Курсовая работа: ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов

В зависимости от температуры и состава мембраны могут существовать в различных физических фазах. При понижении температуры мембраны обнаруживают свойства твердых тел, при повышении температуры они переходят в жидкокристаллическое состояние, которое характеризуется большей подвижностью молекул в плоскости мембраны. В жидкокристаллическом состоянии найдено, что коэффициенты латеральной диффузии почти так же высоки, как и в воде. Как правило, в таком состоянии находятся биологически активные мембраны при физиологических условиях. Ограничение движения в одной плоскости приводит к тому, что в спектрах ЯМР наблюдаются достаточно широкие линии, так как в данном случае изотропное движение невозможно.

Ниже температуры перехода ширина спектральных линий очень велика и составляет несколько миллионных долей, что соответствует значениям, наблюдаемым для спектров ЯМР в твердых телах.

Так как фосфолипиды содержат фосфатные группы, с помощью ЯМР ³¹ С можно наблюдать фосфорсодержащие липосомы. Выше температуры фазового перехода при благоприятных условиях в искусственных мембранных везикулах можно наблюдать сигналы от различных фосфолипидов. В малых везикулах удается различить линии, соответствующие фосфолипидам, находящимся на внутренней и внешней сторонах мембраны. Для более надежного отнесения соответствующих резонансных линий фосфолипидов на внутреннюю или внешнюю поверхность мембраны, необходимо добавить парамагнитное вещество, для которого проницаемость мембраны невелика, и в основном будет наблюдаться связывание этого вещества с фосфолипидом, находящимся на одной из сторон поверхности. Резонансные линии липидов, связанных с парамагнитным веществом, в этом случае сильно уширяются и практически не наблюдаются в спектре. Спектры ЯМР ³¹ Р липосом также являются подтверждением сделанного ранее вывода о том, что увеличение напряженности магнитного поля далеко не всегда обеспечивает более высокое разрешение, так как для ядер фосфора вклад в релаксацию за счет анизотропии химического сдвига будет значительным. В этом случае скорость релаксации возрастает как квадрат напряженности магнитного поля), а разность значений химических сдвигов увеличивается с ростом поля линейно, поэтому уширение линий может компенсировать возрастание разрешения.

По этой причине в рассмотренных выше системах для более сильных полей не удается различить сигналы от фосфолипидов, находящихся на внутренней и наружной сторонах мембраны. Конечно липиды, входящие в состав мембран, можно исследовать с помощью ЯМР *Н. В этом случае удается отдельно наблюдать сигналы от различных групп, входящих в состав липидов. По спектрам ЯМР ¹³ Си'Н при условии, что изотопное замещение проводится по строго определенным положениям, удается селективно наблюдать атомы, находящиеся в длинных углеводородных цепочках.

Липидные мембраны обладаю т тем характерным свойством, что молекулы липидов определенным образом упорядочены. В одном из предельных случаев все молекулы полностью упорядочены, как в кристаллическом состоянии. Другим предельным случаем является статистический порядок, который в большей или меньшей степ ени наблюдается для жидкостей и порошкообразных сред. Для количественного описания степени упорядочения, называемого жидкокристаллическим, исп ользуется понятие параметра порядка. Эта величина является мерой макроскопического упорядочения некоторой величины в образце: например, упорядочения направления вектора, соединяющего два выделенных атома в молекуле, относительно некоторой оси. Параметр порядка может быть определен как величина, которая принимает значение, равное единице, если соответствующие величины, измеряемые в молекулах, являются одинаковыми для всех молекул, и значение, равное нулю, если эти величины принимают все возможные значения. На практике параметр порядка не всегда допускает такую простую и наглядную интерпретацию, а также не всегда удается установить непосредственную связь с величинами, которые могут быть измерены по спектрам.

Важные результаты, необходимые для установления структуры мембран, могут быть получены для ориентированных мембран с помощью резонанса на ядрах дейтерия. Ориентация создается следующим образом. Мембрану помещают между двумя тонкими стеклянными пластинами, каждая из которых задает ориентацию прилежащего слоя, т.е. получается двойной слой. При проведении экспериментов необходимо, прежде всего, решить проблему улучшения отношения сигнал/шум. Здесь существует достаточно простой вариант решения: для этого необходимо сложить несколько стеклянных пластинок с мембранами стопкой и получить спектр в таком образце. При наличии ориентации спектры мембран переходят из области резонанса, характерного для жидкости, когда вследствие изотропного движения большая часть взаимодействий полностью усредняется, в область резонанса, характерного для твердых тел. В ориентированных системах наблюдается расщепление резонансных линийБн, которое зависит от ориентации системы относительно внешнего магнитного поля и характеризуется константой квадрупольного взаимодействия, отличной от нуля для дейтерия, спин ядра которого равен единице. В жидкокристаллическом состоянии вращательная диффузия относительно оси, перпендикулярной поверхности мембраны, как правило, происходит с достаточно высокими скоростями, поэтому различия в спектрах, наблюдаемых для молекул, находящихся в этих плоскостях, усредняются до нуля. Величина квадрупольного расщепления ДV зависит от угляи между направлением связи ¹³ С – ² Н и нормалью к плоскости мембраны, а также от угла, который составляет эта нормаль по отношению к внешнему магнитному полю. Соответствующий параметр порядка определяется по следующей формуле:

Если рассмотреть не ориентированную мембрану, а липосому и провести усреднение по всем возможным направлениям нормали к поверхности мембраны, то найдем максимум, соответствующий перпендикулярной ориентации. Следовательно, в полном спектре будут наблюдаться в основном дублетные сигналы от этих молекул, и получим два максимума. Наблюдаемое расщепление дается формулой

где h – постоянная Планка, e ² q – квадрупольный момент дейтерия S_CD – градиент электрического поля в направлении связи ¹³ С – Н. На рис. приведен спектр ЯМР ² Н реконструированных саркоплазматических везикул ниже и выше температуры ф азового перехода. Жирные кислоты мембранных липидов селективно помечены дейтерием в положениях 9 и 10. При встраивании саркоплазматической АТ Фазы в мембрану наблюдаемая константа квадрупольного взаимодействия убывает, т.е. параметр порядка уменьшается. Ниже температуры перехода наблюдается уширенный спектр, типичная ширина линий которого характерна для состояния геля. Встраивание протеина в мембрану еще более сильно сказывается на виде спектра ЯМР.