Курсовая работа: Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы
2. Бактериальную суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и равномерно распределяли по площади квадрата.
3. Препараты подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем 2 – 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.
4. Подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп марки «Биолам» с масляной иммерсионной системой при увеличении 10×1,0×100.
Для прямого счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9 маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей зрения.
Общую численность бактерий в 1 г почвы (Nобщ. )определяли по формуле:
S × Σ ni
N общ. = z × s × v × 100 [кл/г], где
S – общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм2 );
Σni – сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;
z – количество просмотренных полей зрения (15);
s – площадь одного поля зрения (1089× 10-6 мм2 );
v – объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);
100 – разведение первоначального образца почвы в 100 раз.
Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.
1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов
Определение количества клеток сапротрофов (Nсапр. )проводили высевом на жидкую питательную среду – мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки – 17,9; NaCl – 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди [7].Готовилиряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1 до 10-7 . Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 0 С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].
Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na2 HPO4 – 0,8 г; KH2 PO4 – 0,5 г; NH4 Cl– 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; CaCl2 – 0,1 г; FeSO4 ×7H2 O –15 мг; дрожжевой экстракт – 0,1 г ; пептон – 0,2 г; агар – 15 г; глюкоза – 0,2 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (Nолиг. ) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1 до 10-9 .По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ2 , рассчитываемому по формуле [7]:
( ni – n )2
χ 2 = п ,
где п i – число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п – их среднее значение.
Различие считается значимым при χ 2 не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п ) на численность бактерий соответствующей группы (N ) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:
n × r
N олиг. = v [кл/г],
где п – среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – величина разведения; v – объем образца, посеянного на чашку (мл).
Кроме того, рассчитывали отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.
2 Результаты и обсуждение исследования
Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.
Таблица 1
Общая численность бактерий в почвенном профиле
дерновой альфегумусовой глеевой почвы
| Горизонты (расположены от верхнего к нижнему) |
Численность бактерий, кл/г сухой почвы |
| 1. |
(5,35±0,05)× 109 |
| 2. |
(6,2±0,1)×109 |
| 3. |
(4,8±0,15)×109 |
| 4. |
К-во Просмотров: 160
Бесплатно скачать Курсовая работа: Исследование бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы
|