Курсовая работа: Методы выделения антибиотиков
Келлер-Ширлайн и Ронкари исследовали гидролиз продуктов ланкамицина.
ЭРИТРОМИЦИНЫ
Андерсон разделял эти антибиотики на тонких слоях силикагеля, элюируя смесью метиленхлорид—метанол—бензол— формамид (80:20:20:2—5). Влажность атмосферы лаборатории определяет процентное содержание формамида в раство-. рителе. Чем выше влажность, тем меньше требуется формамида для разделения. Так, при 20 %-ной ОВ (относительная влажность) требуется 5 объемов формамида, а при 30—40 %-ной — 3—2 объема. Пятна обнаруживали опрыскиванием 10 %-ной фосфомолибденовой кислотой в этаноле или 50 %-ным раствором серной кислоты. В обоих случаях после опрыскивания пластинки нагревали на горячей плитке. Фосфомолибденовая кислота — более чувствительный реактив, но обработанные ею пятна обесцвечиваются через 1—2 ч, поэтому, если хромато-грамму нужно сохранить, следует предпочесть обугливание серной кислотой.
Мальчевска-Конецка и др. разделяли эритромицины А и С и ангидроэритромицин на силикагеле, используя верхний слой смеси этилацетат—изопропанол—15 %-ный ацетат аммония (9:7:8), рН которого доведен до 10,1. Обнаружение прово проводили смесью 0,15 %-ный раствор ксантидрола в смеси соляная кислота—уксусная кислота (12:1). Чувствительность определения составляла 0,05 мкг. Ричард и др. использовали смеси метанол — 0,02 н. ацетат натрия (4:1) на силикагеле G, приготовленном с 0,02 н. ацетатом натрия, для отделения эритромицина, эстолата эритромицина и этилсукцината эритромицина от некоторых продуктов разложения и фармацевтических сопутствующих продуктов. Эти же авторы определили Rf 23 других антибиотиков. Радецка и др. [26] применили прямой денситометрический метод для определения эритромицина и эстолата эритромицина в капсулах с теми же разделяющими средами. Обнаружение осуществляли реактивом Т-139. Точность данных колебалась от 2,1 до 3,4 % при чувствительности определения 5 мкг.
Майерс и Смит описали методику биоавтографического анализа на незакрепленных слоях эритромицина и других антибиотиков. После завершения разделения хроматограммы сушат и покрывают увлажненной фильтровальной бумагой, положенной на чистую стеклянную пластинку. Затем хроматографиче-скую пластинку переворачивают и края фильтровальной бумаги загибают назад, «а носитель слоя. Удалив .наружную стеклянную пластинку, прижимают бумагу, покрывающую слой, к зернистому слою агара (авторы приводят подробную методику приготовления такого слоя агара с использованием Streptococcus lactis) и выдерживают 2 ч при 37 °С.
Истербрук и Херсей разработали метод тонкослойного анализа эритромицина и его эфиров с Sarcina lutea ATCC 9341 в качестве организма для испытания. Площадь зоны торможения измеряли, проецируя изображение на экран при 12-кратном увеличении. Установлена линейная зависимость между логарифмом концентрации вещества и корнем квадратным из площади пятна. Чувствительность определения на слоях, нанесенных на алюминий, колеблется в пределах от 0,03 мкг для оснований и стеаратов и до 0,05 мкг для эстолатов. Системами разделения служили системы Ричарда и др. ; пластинки предварительно промывались.
ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Насбаумер разделил пенициллины после кислотного гидролиза. Анализируя продукт разложения пенициллина, он исследовал влияние 40 различных компонентов на идентификацию пенициллияов методом ТСХ. Этот же автор изучил возможность спектрофотометрического определения пенициллинов в различных фармацевтических препаратах. Прямому анализу этих антибиотиков мешают полиэтиленгликоли и стеараты натрия, однако предварительное разделение методом ТСХ позволяет отделить пенициллины от мешающих анализу соединений. Слои для хроматографического разделения приготавливают так: смешивают 20 % рисового крахмала с силикагелем G в фосфатном буфере (рН 5,8). Элюирование проводят смесью бутилацетат—н-бутанол—уксусная кислота—фосфатный буфер (рН 5,8) — метанол (80 : 15 : 40 : 24 : 5).
Мак-Гильверей и Стрикленд разделили группу пенициллинов на слоях целлюлозы MN 300 и на слоях силикагеля G. Для разделения ампициллина и гетациллина на слоях силикагеля вполне пригодна также смесь ацетон—ускусная кислота. Эти системы не позволяют отделить диклоксациллин от нафциллина или фенициллин от феноксиметилпенициллина. Нафциллин можно обнаружить по интенсивной желтой окраске, которую он дает с 50 %-ной серной кислотой. Кроме нафциллина желтую окраску дает только метициллин, но у него другая величина Rf. Биаджи и др. исследовали влияние рН на разделение методом ТСХ с обращением фаз пенициллинов и сефалоспоринов. Экстраполированные величины RM для пенициллинов приведены в табл. 18.6. Аутергофф и Кинцлер делили пенициллины на силикагеле G, элюируя пробу смесью бензол—этилформиат— муравьиная кислота (80:15:6). Продукты расщепления окса-циллина и феноксиметилпенициллина были проанализированы хроматографически Корчагиным и сотрудниками . Вандамм и Фоетс использовали 4 следующие смеси растворителей при разделении продуктов спонтанного химического и ферментативного разложения пенициллинов и двух цефалоспоринов на силикагеле G: н-бутанол—вода—этанол—уксусная кислота (5:2:1,5:1,5), н-бутанол—вода—уксусная кислота (4:1:1), ацетон—уксусная кислота (19:1) и 85 %-ный ацетон.
Манни и др. применили метод измерения отражательной способности in situ для определения натрийпенициллина G в фармацевтических препаратах. После хроматографического разделения на силикагеле со смесью ацетон—хлороформ—уксусная кислота (10:9: 1) авторы измеряли отражательную способность пятен в области 230 нм. Стандартное отклонение составило 5% для зон, содержавших 1 мкг пробы, и 1,5% для зон, содержавших 10 мкг. Синсхаймер и др. определяли флуоресцентным методом in situ следы пенициллина. Бензил-пенициллин гидролизовали пенициллиназой, подвергали затем хроматографическому разделению на силикагеле G со смесью диметилформамид—хлороформ—28 %-ный аммиак (10:5:4) и измеряли при 510 нм интенсивность флуоресценции пятна с Rf 0,50 (длина волны возбуждающего излучения составляла 410 нм). Интенсивность флуоресценции пятен феноксиметил-пенициллина, полученного в результате гидролиза (Rf 0,88), измеряли в области 480 ом при длине волны возбуждающего излучения 260 нм. Метициллин гидролизовали и измеряли интенсивность флуоресценции пятна с Rf 0,73 при 480 нм при возбуждающем излучении 350 нм. Пределы чувствительности в перечисленных выше определениях равны 3, 0,76 и 0,12 мкг соответственно. Пенициллановую кислоту определяли методом флуоресцентной денситометрии пятна с Rf 0,45 при 440 нм с возбуждением при 350 нм. В этом случае после разделения на силикагеле смесью хлороформ—этилацетат—муравьиная кислота (60:40: 1) пластинку выдерживали 3 мин в парах аммиака, чтобы образовался флуоресцирующий продукт. Полуколичественное определение пенициллинов и продуктов их превращения проводили визуально, сравнивая размеры пятен и их окраску .
Цефалоспорин В и некоторые из его производных анализировали хроматографически на силикагеле G, используя смесь н-бутанол—уксусная кислота (10:1), насыщенную водой, а также смесь н-бутанол—пиридин—уксусная кислота—вода (17:12:4:15) . Для некоторых специфических соединений применяли различные комбинации ацетона с бензолом (1:4; 2 : 3) и толуолом (2:3; 1 : 4; 3 : 7; 1 : 9), а также толуола и этил-ацетата (1:1). Биаджи и др. разделили методом ТСХ с обращением фаз 13 цефалоспоринов. Разделение эти авторы проводили на силикагеле, пропитанном силиконом, применяя буферный раствор (рН 7,4) ацетат натрия—веронал, содержавший от 0 до 24 % ацетона. По полученным данным были рассчитаны величины RM. Бури хроматографировал цефалоспорин В, цефалотин и цефалоридин на слоях силикагеля, забуференных фосфатным буфером (рН 5,8), элюируя их смесью изопропанол – метанол – фосфатный буфер с рН 5,8 (2:7:1).
РИФАМИЦИНЫ
Эти антибиотики разделяли с помощью ряда спиртов и ацетона на слоях силикагеля G . Ацетон оказался лучшим растворителем; проводя элюирование ацетоном, удается отделить рифамицин В от рифамицина О, рифамицин SV от ри-фамицина S, а рифамицин В от рифамицина SV. Эти соединения интенсивно окрашены, и поэтому при достаточно высоких концентрациях их можно обнаружить на пластинках, не применяя реактив. Однако микробиологическим методом их можно обнаружить при гораздо более низких концентрациях. Для 2 — 20 мкг рифамицина и дезацетилрифамицина Колос и Эйдус приводят величины Rf (0,55 и 0,37 соответственно), полученные при хроматографировании смесью хлороформ—этанол—0,1 н. соляная кислота (84:15,9:0,1) на хроматографических полосах № 6060 фирмы Eastman. Меджи и др. провели хроматографический анализ группы полусинтетических рифамицинов на силикагеле с ацетоном.
ТЕТРАЦИКЛИНЫ
Николаус и др. исследовали также разделение тетрациклинов на тонких слоях силикагеля G. Они изучили большое число растворителей; четыре лучших растворителя указаны в табл. 1.2, там же даны соответствующие величины Rf. В дополнение к приведенным в таблице результатам следует указать, что окситетрациклин и диметилтетрациклин можно отделить от тетрациклина, хлортетрациклина и дезокситетрациклина, элюируя смесь 10 %-ным раствором лимонной кислоты, насыщенным бутанолом. Обнаруживают тетрациклины, опрыскивая пластинки 1 н. соляной кислотой и затем нагревая их при 50 °С. Тетрациклины обнаруживают в виде желтых пятен. Для обнаружения дезокситетрациклина используют реакцию сочетания с солью диазония. При проведении микробиологической пробы агар заражают Bacterium subtilis.
Таблица 2.1
Величины Rf X 100 некоторых тетрациклинов, полученные с различными хроматографическими системами
| Соединение | Силикагель | Кизельгур | |||||
| А | Б | В | Г | Д | Е | Ж | |
|
Тетрациклин Хлортетрациклин Ангидротетрациклин Окситетрациклин Ангидрохлортетрациклин Диметилхлортетрациклин Метациклин Доксициклин 4-Эпитетрациклин Эпиангидротетрациклин 4-Эпихлортетрациклин |
36 К-во Просмотров: 243
Бесплатно скачать Курсовая работа: Методы выделения антибиотиков
| ||||||