Курсовая работа: Способы получения ферментов
При выделении ферментов применяется ограниченный круг адсорбентов. Широко используется в лабораторных работах фосфат кальция, особенно в кристаллической форме, известной как гидро- ксилапатит. Недостаточно совершенные его механические свойства и ограниченность размера гранул сдерживают применение гид- роксилапатита в колоннах крупных масштабов. Однако недавно проведенные работы свидетельствуют о прогрессе в данном вопросе. При лабораторных работах в определенной мере применяется также алюминий, особенно в форме у-алюмогеля. Однако его механические свойства неудовлетворительны, а текучесть выражена крайне слабо. Для адсорбции белков п редких случаях, но все же применяется диатомитовая земля.
Побочная адсорбция белка при применении диатомитовой земли в качестве основы грунтовочного слоя при фильтрации представляет серьезную проблему.
4.2. Фракционирование посредством ионного обмена.Раздробленные вещества с ионообменными свойствами предста- ляют собой наиболее важные твердофазные продукты для фракционирования ферментов. Широкое индустриальное применение нашли материалы, у которых ионообменные группы присоединены к гидрофобным остовам, как это имеет, например, место у сополимера дивинилстирола. Однако их применение к решению задач получения ферментов ограничивается случаями, когда идет речь об устойчивых ферментах, имеющих небольшие молекулы. Эти ограничения обусловлены слаборазвитой пористостью материалов, которые имеют требуемый размер пор. К тому же гидрофобные остовы молекул полимеров могут в потенции оказывать дестабилизирующее влияние на ферменты. Широко используются в лабораториях ионообменники на основе целлюлозных и декстрановых остовов. Как и в случае адсорбции, общепринято начинать хроматографическое разделение с добавления к системе белка, предполагая, что некоторые или все компоненты смеси прочно связаны друг с другом.
4.2 Сорбция-десорбция
Препаративная хроматография па границе фаз твердое вещество — жидкость представляет собой самую медленную операцию в общей технологической схеме выделения ферментов. Хотя этот метод не имеет равных по фракционирующей способности, известно множество примеров, когда этой способностью жертвуют ради достижения более высокой производительности. Как было показано для проведения процессов адсорбции, ионного обмена и аффинной хроматографии наиболее пригодны периодические методы. Периодические процессы сорбции-десорбции могут проводиться или в колонках насадочного типа, или путем перемешивания адсорбента с раствором фермента в аппарате емкостного типа с мешалкой с последующим применением метода сепарации и отделения твердой фазы от жидкой. Требования к конструкции насадочных колонок в этом случае могут быть менее строгими, чем в случае зональной хроматографии, так как в процессах сорбции-десорбции желательно использовать весь объем насадки. Однако и при этом следует обеспечить поршневое течение жидкости.
Альтернативный метод, включающий стадию отделения твердой фазы от жидкой, может быть реализован различными путями. При работе с плотными гидрофобными гелями осаждение в поле силы тяжести может быть адекватно стадии вторичной промывки. Для гидрофильных носителей желательно применение центрифугирования или фильтрации. При центрифугировании могут использоваться роторные центрифуги, центрифуги со сплошным ротором или сепараторы. Роторные центрифуги отличаются ограниченной производительностью, а разливающиеся на входе в эти машины суспензии срезающие усилия могут вызывать абразивное повреждение ее компонентов. Эта отличительная способность к повреждению присуща также и применяемым иногда спиральным центрифугам. Отвечают условиям процесса разделения фаз высокопроизводительные центрифуги со сплошным ротором. Но идеальными в этом отношении являются сепараторы, обеспечивающие эффективное обезвоживание и промывку осадка. Если необходимо, могут быть оборудованы автоматическим устройством для разгрузки твердой фазы с помощью приводного поршня.
Если структура осадка позволяет, процессы сорбции и десорбции могут осуществляться при применении адсорбента в движущемся роторе. Дополнительно возможно проведение стадии элюирования, что повышает эффективность разделения. Однако при осуществлении указанной стадии следует соблюдать особую осторожность, поскольку межповерхностные области между порциями растворителя для элюирования могут приводить к образованию ложных профилей процесса элюирования с неупорядоченным распределением в растворителе ферментов. Для решения проблем, связанных с обессоливанием вязких белковых растворов в насадочных колонках, соответствующая операция обессоливания посредством гельфильтрации может проводиться в барабанных центрифугах. Для удаления внешней влаги гель сначала обрабатывают при высоких частотах вращения центрифуги, а затем при малых частотах вращения в нее вводят белковый раствор. Соли и органические соединения с низкой молекулярной массой заполняют тонкие поры геля, в то время как белковые молекулы выбрасываются из него при высоких частотах вращения. Образующийся осадок затем промывают водой.
Выделение и очистка фермен?