Курсовая работа: Стійкість до голодування і активність АДГ у Drosophila melanogaster із природних популяцій України

Результати численних досліджень показали наявність в усіх природних популяціях Drosophila melanogaster двох варіантів АДГ, що відрізняються электрофоретично – АДГ-F иАДГ-S . Вони знаходяться під контролем структурного гена Adh , що локалізований в хромосомі 2 в положенні 50.1. Амінокислотні послідовності білків класу АДГ-F відрізняються від таких класу АДГ-S заміною лізину на треонін в позиції 192. Ця амінокислотна заміна торкається тієї області, яка являється каталітичним доменом ферменту, що і лежить в основі різниці у відносній активності, термостабільності та інших властивостях алозимів [Chambers, Wilks et al., 1984]. Завдяки генетичному поліморфізму, локус Adh відіграє важливу роль в генотипічній адаптації дрозофіли до факторів зовнішнього середовища.

При електрофорезі в поліакриламідному гелі АДГ виявляється в виді двох – трьох зон із головною катодною смугою (АДГ-5) та додатковими більш рухливими смугами (АДГ-3 і АДГ-1). У АДГ-S, яка є менш рухливою, смуги на електрофореграмах зміщуються ближче до катоду і займають положення 7, 5, 3 відповідно [Крутовський, 1983; Chambers, 1984; 1991; Johnson, 1964; Schwartz, 1976].

Встановлено, що при тривалому голодуванні мух, або при їх обробці низькими концентраціями ацетилацетону, проявляється високий рівень експресії АДГ-1 та АДГ-3 за рахунок конверсії алозимного спектру. Дія на мух різних концентрацій етанолу призводила до ретроконверсії молекулярних форм АДГ [Heinstra, 1986].

Припускається [Mckechnie, 1984], що взаємне перетворення модифікованих молекул АДГ, що характеризуються різною стабільністю та кінетичними характеристиками, є важливою ланкою в складній системі адаптації Drosophila melanogaster до екзогенного етанолу. Відповідно до цієї гіпотези екзогенний етанол стимулює ріст активності АДГ, збільшуючи співвідношення НАДН / НАД, тим самим знижуючи відносну кількість АДГ-1 на користь АДГ-3 та АДГ-5.

Здійснюючи регуляцію рівнів НАД / НАДН і НАДР / НАДРН, які в свою чергу регулюють розпад інших ферментів, АДГ також впливає на життєздатність дрозофіли [Xinmi, 1992]. Очевидно, такий спосіб регуляції активності фермента − найбільш важливий в процесах адаптації [Anderson,1983].

Численні дослідження показали, що здатність мух до існування в умовах з високим вмістом алкоголю знаходяться в залежності від рівня активності їх АДГ [Pecsenye, 1994; 1997]. Хоча вирішальне значення для виживання мух при збільшених концентраціях спирту відіграє абсолютна кількість АДГ, а не активність ферменту [Anderson, 1983]. Це підтверджено імунохімічними та молекулярно-біологічними дослідженнями. Так, встановлено, що кількість білку АДГ визначається швидкістю синтезу, що позитивно корелює із рівнем цитоплазматичної мРНК [Anderson,1983; Birley, 1984]. Таким чином, регуляцію активності АДГ за рахунок зміни кількості ферментного білку на різних стадіях розвитку Drosophila melanogaster можна вважати достовірно встановленою.

В зв’язку із важливою роллю ген-ензимної системи АДГ в процесах метаболізму і адаптації дрозофіли, рівень активності та інші характеристики алкогольдегідрогенази можна розглядати як критерій пристосованості генотипу.

2. Матеріали та методи досліджень

Дослідження проводили на мухах Drosophila melanogaster , що відносяться до родини Drosophilidae із відділу Diptera . Дрозофіла є класичним об’єктом генетичних досліджень, завдяки наступним властивостям. По-перше, у неї порівняно короткий період онтогенезу; по-друге, вона легко виживає та розвивається в лабораторних умовах, а також не потребує значних витрат на розведення та харчування.

Для цих мух комфортною температурою вважається 24 – 25С. При такій температурі цикл розвитку дрозофіли від яйця до дорослої мухи складає приблизно 10 діб. Розвиток яйця триває 20 годин, а розвиток личинки і лялечки – 8 діб. Таким чином за рік можна отримати до 40 поколінь дрозофіли. При температурі вищій за 31С дрозофіла стає безплідною, хоча в природних умовах вона може витримувати і більш високі температури. Зі зниженням температури цикл розвитку мух дуже уповільнюється. Так, при температурі 10С період личинки та лялечки значно зростає у часі.

культивування мух із досліджуваних популяцій проводили у скляних банках (200 мл) при температурі 24С у стандартних умовах. для годування дрозофіли зазвичай використовують корм із дріжджами. Крім них також використовували: цукор як субстрат для розвитку дріжджів та агар-агар, що надає корму желеподібної консистенції. Харчову масу готують із наступних співвідношень компонентів на 1 літр води:

агар-агар – 50 г

цукор-пісок – 36г

манна крупа – 36г

дріжджі – 27г

В ході експерименту аналізу піддавали мух із популяцій різного походження – К (Київ), Од (Одеса), В (Варва), П (Пирятин), Оз (Озеро із Чорнобильської зони) та сад (Яблуневий сад із Чорнобильської зони), що були люб`язно надані співробітниками кафедри генетики Київського національного університету ім. Т.Г. Шевченка.

Тривалість життя мух за голодування досліджували наступним чином. У пробірки (10 мл) без корму поміщали окремо по 10 самок та самців кожної популяції. Використовували особин триденного віку, попередньо на протязі трьох діб вони мали можливість харчуватися. Спостереження за досліджуваними мухами проводили з інтервалом у три години (вісім разів на добу). При цьому визначалася кількість особин, що вижили. В перші дні досліду смертність мух ще не дуже висока, пізніше починається масова їх загибель. Підрахунок вели до моменту загибелі половини мух у пробірці (Lt ₅₀ ). Тривалість життя мух за умов голодування виражали у годинах. Досліди проводили в десятикратній повторності.

Активність АДГ в экстрактах тканин дрозофіли визначали спектрофотометрично на СФ-26, використовуючи інкубаційну суміш наступного складу: 0,05 М тріс-НCL буфер, pH 8,5; 1,2 мM NAD ⁺ ; 0,1 M спирт. Активність ферменту оцінювали по збільшенню вмісту NADН в середовищі інкубації на протязі 3 хвилин. В якості субстрату використовували ізопропанол. Активність АДГ виражали в нмолях NADН /хв∙мг білку [McKechnie, Geer, 1984].

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали за допомогою критерія Стьюдента (Рокицкий, 1973)

1). Визначали середнє значення тривалості життя в умовах голодування:

, де

М – середнє значення тривалості життя при голодуванні; n – кількість дослідів.

2). Визначали квадратичне відхилення:

, де

М – а – різниця середнього та індивідуальних значень тривалості життя.

3). Визначали помилку середньоарифметичного значення тривалості життя:

, де

m – помилка середньоарифметичного значення;  – квадратичне відхилення

При р > 0.05 відмінності не достовірні;