Рис. 3. Азотобактер (Azotobacterchroococcum)

Близькі до азотобактера вільноживучі азотфіксатори з роду Beijerinckia. На відміну від азотобактера, вони можуть рости навіть при рН = 3. Ці бактерії мають різну форму, бувають рухливими і нерухливими; за енергією фіксації азоту вони близькі до азотобактера.

Серед вільноживучих азотфіксуючих бактерій слід згадати про види роду Derxia і Azotomonasfluorescens.

Пошуки вільноживучих азотфіксаторів дали змогу виявити їх і в інших родинах — Spirillaceae, Rhizobiaceae, Achromobacteriaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae та ін. Здатність до фіксації молекулярного азоту мають анаеробні пурпурні та зелені фототрофні бактерії, що живуть у заболочених озерах і мулі, деякі мікобактерії, спірохети, проактиноміцети і навіть окремі види грибів, у тому числі дріжджі.Використання методу мічених атомів дозволило підтвердити припущення, висловлене ще в 1889 p., про те, що одна з найбільших груп мікроорганізмів, які населяють ґрунти, — мікроскопічні водорості — можуть засвоювати атмосферний азот. Серед них близько 40 видів синьозелених водоростей. До найпоширеніших належать Anabaena, Amorphonostoc, Aulosira, Calothrix, Nostoc, Scytonema тощо.

В Японії використання штучного зараження ґрунтів синьозеленими водоростями Tolypothrixtennuisвиявилось ефективним при вирощуванні рису. Подібних результатів досягли також в Індії від застосування на рисових полях синьозелених водоростей — Aulosirafertilisima.

Досліди, проведені в Інституті мікробіології Російської АН, показали, що синьозелені водорості (ціанобактерії) під час інтенсивного розвитку можуть нагромаджувати за вегетаційний період до 50—70 кг азоту на 1 га.

Останніми роками вчені різних країн приділяють велику увагу вивченню процесу фіксації азоту мікроорганізмами, які містяться на корінні і в прикореневій зоні небобових рослин. Ці мікроби дістали назву ризосферних, а процес зв'язування ними молекулярного азоту називається асоціативною азотфіксацією.

Азотфіксуюча активність виявлена у представників багатьох родів ризосферних бактерій: Agrobacterium, Achromobacter, Aquaspi-rillum, Azospirillum, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Enterobac-ter, Erwina, Flavobacterium, Klebsiella, Mycobacterium, Pseudomonas, Rhodospirillumта ін.

Хімізм фіксації молекулярного азоту. Метод Габера—Боша, до якого вдаються нині, щоб одержати з атмосферного повітря NH₃ , потребує високих температур і тиску. Натомість біологічна фіксація азоту відбувається за звичайних умов.

Але процес зв'язування молекулярного азоту досить енергоємний. Щоб розірвати три зв'язки, між двома атомами в молекулі азоту необхідно затратити 941 кДж/моль. Експериментально доведено, що під час розвитку азотфіксатори, які зв'язують молекулярний азот, на одиницю маси новоутворених клітин витрачають більше енергії, ніж при рості на сполуках азоту.

Зв'язування молекулярного азоту може відбуватися двома шляхами: відновленням або окисленням. Кожен з цих шляхів є багатоступінчастим і каталізується своїми ферментативними системами. Більшість дослідників вважають, що фіксація N₂ здійснюється за відновним шляхом.

Перші досліди з вивчення ферментного комплексу, який забезпечує процес фіксації N₂ , було проведено ще в 1934 p., коли відомий російський біохімік О.М.Бах (із співробітниками) зробив спробу одержати безклітинний препарат, який містить ферментний комплекс, що зв'язує молекулярний азот. Однак це складне завдання завдяки зусиллям багатьох вчених було розв'язано значно пізніше.

Ферментна система, яка відповідає за фіксацію N₂ , називається нітрогеназою. Вона складається з двох білкових компонентів. Один із них містить Мо і Fe і називається молібдофередоксином, а другий містить тільки Fe і називається азофередоксином. У складі останнього, як і в молібдофередоксині, є сульфідні групи. Молібдофередоксин (Mo-Fd) інактивується киснем, а азофередоксин, навпаки, чутливий до кисню (Azo-Fd). Нітрогеназа здійснює процес, при якому водень відновної сполуки переноситься на N₂ з утворенням NH₃ . Активування азоту і водню в клітинах азотфіксаторів, необхідних для перетворення N₂ на NH₃ , здійснюється також фередоксином — білком негемінової природи (Fid). Водень у мікробній клітині може утворюватися у низці процесів. Молекулярний азот і водень активуються електронами, які утворюються в ланцюзі окислювально-відновних процесів.

Незалежно від безпосереднього джерела електронів вони повинні передаватись в нітрогеназну систему відновником з низьким потенціалом, який містить негемінове залізо, — переносником електронів (Fd):

У ланцюгу перенесення електронів, який складається із фередоксину (Fd), азофередоксину (AzoFd), і молібдофередоксину (MoFd), за один раз переносяться тільки два електрони (для останнього перенесення потрібно витратити одну молекулу АТФ). Але для відновлення N₂ до NH₃ потрібно шість електронів, а тому реакція повинна складатися із послідовних двоелектронних стадій. Характерно, що в реакційній суміші ніколи не знаходили частково відновлених проміжних продуктів. Вважають, що вони залишаються зв'язаними з ферментом, і відновлення відбувається через такі проміжні стадії:

Встановлено, що нітрогеназа може відновлювати не тільки молекулярний азот, а й інші сполуки. На здатності нітрогенази відновлювати ацетилен до етилену ґрунтується непрямий метод її визначення, який знайшов широке застосування на практиці (R.Hardy, 1973).

Аміак, який утворюється при відновленні молекулярного азоту, реагує з кетокислотами бактеріальної клітини (піровиноградною, щавлевооцтовою тощо), в результаті чого утворюються амінокислоти.

При наявності сполук перехідних металів — титану, ванадію, хрому, молібдену і заліза — відбувається активація N₂ у звичайних умовах. При цьому утворюються комплексні сполуки, які розкладаються водою до аміаку. Отже, дані, одержані вітчизняними і зарубіжними вченими, дають змогу сподіватися на те, що через певний час буде розроблено промисловий метод м'якої хімічної фіксації молекулярного азоту.

Функціонування мультиферментного комплексу нітрогенази визначається особливими генами (nif-генами). Інтенсивно проводяться роботи з вивчення можливості штучної передачі цих генів від азотфіксуючих мікробів іншим мікроорганізмам, які не здатні фіксувати N₂ .

Цікаві дані щодо цього одержано при перенесенні групи nif-генів бактерії Klebsiellapneumoniae до клітини Е.соіі. Спочатку перенесення здійснювалося введенням nif-генів до плазмід, які потім було введено в Е.соlі. Відомо, що Е.соlі не фіксує N₂ . Новий штам Е.соlі набув властивостей синтезувати нітрогеназу і завдяки цьому виявився здатним до фіксації N₂ .

Успіх цього експерименту вселяє надію, що методами генної інженерії незабаром вдасться створити рослини пшениці, кукурудзи та інших культур, які матимуть здатність фіксувати N₂ . Значення цього відкриття для агровиробництва важко переоцінити.

РОЗДІЛ 2. ШЛЯХИ ПЕРЕТВОРЕННЯ АЗОТУ

2.1 Процеси амоніфікації як перший етап перетворення азоту

Одним із основних шляхів перетворення азоту в ґрунті є гниття, або розклад білків мікроорганізмами, який дістав назву процесу амоніфікації. Це складний багатофазовий процес, кінцеві результати якого залежать від будови й складу білка, умов, у яких відбувається розклад, і від збудників, що спричинюють його. Гниття білків починається з їхнього гідролізу під впливом протеолітичних ферментів, які виділяються мікроорганізмами в оточуюче середовище. Процесу амоніфікації піддаються не тільки білки, а й їхні похідні — пептони, пептиди, амінокислоти, а також нуклеїнові кислоти та їхні похідні — пуринові і піримідинові основи, сечовина, сечова кислота, складний азотовмісний цукор хітин і гумусові кислоти.

Первинними продуктами гідролізу білків є пептони і пептиди, які далі розщеплюються до кінцевих продуктів гідролізу — амінокислот, останні використовуються мікробами або перетворюються ними на аміак і інші сполуки залежно від природи самих амінокислот і ферментів мікроорганізмів. Перетворення амінокислот найчастіше відбувається через дезамінування. Наприклад, гідролітичне дезамінування супроводжується утворенням оксикислот і аміаку:

R - CHNH₂ COOH + Н₂ О → R - СНОНСООН + NH₃ .

Після дезамінування вуглецевий залишок перетворюється мікробами в аеробних або анаеробних умовах до утворення СО₂ і різних органічних сполук. В аеробних умовах продукти розкладу білків повністю мінералізуються, утворюються СО₂ , Н₂ О, NH₃ , H₂ S, H₂ . В анаеробних умовах повної мінералізації проміжних продуктів розкладу амінокислот не відбувається. У цьому випадку поряд з СО₂ і NH₃ нагромаджуються різні органічні кислоти, спирти, аміни тощо.

При розкладі амінокислот ароматичного ряду утворюються проміжні продукти: фенол, крезол, скатол, індол, які мають дуже неприємний запах. Сірководень та його похідні — меркаптани — утворюються під час гідролізу сірковмісних амінокислот.