Лабораторная работа: Сбор и хранение материала, количественное определение 17 – КС по реакции Циммермана

5. Определение содержания 17 – КС в моче по реакции с метадинитробензолом (реакция Циммермана в модификации Креховой).

Принцип метода : количественное установление содержания специфически окрашенных в фиолетовый цвет экстрагированных хромогенов, образующихся в результате реакции17 – КС с метадинитробензолом в щелочной среде.

Реактивы:

1.диэтиловый (медицинский) эфир, свободный от перекисей

2.абсолютный этанол, очищенный от альдегидов и кетонов - см выше

3.концентрированная соляная кислота, 1,19 кг/л

4.ледяная уксусная кислота

5.раствор едкого натра, 100 г/л

6.5 н. раствор едкого калия в метаноле (применяемый в качестве растворителя метанол делает реактив более устойчивым, увеличивая срок его хранения). 28 г едкого калия доводят до 100 мл метанолом, после чего раствор немедленно фильтруют (в спиртовом растворе щелочи образуются желто-окрашенные продукты, которые обусловливают высокие значения абсорбции контрольной пробы). После фильтрования раствор щелочи титруют 0,1 н. соляной кислотой с индикатором метилоранжем. Реактив хранят в темной запарафинированной склянке в холодильнике. Он годен до 1,5 мес.

7.спиртовой раствор метадинитробензола, 20 г/л.

Перед использованием проверить чистоту метадинитробензола: 400 мг реагента растворяют в 20 мл абсолютного этанола, он не должен давать окраски в течение 1 часа после прибавления к нему равного объема 3 н. раствора едкого калия. В противном случае реактив перекристаллизовывают.

Перекристаллизация метадинитробензола: 10 г его препарата растворяют в 375 мл 96 % этанола и нагревают до 40 С. К раствору доливают 50 мл 2 н. едкого натра и смесь оставляют на 5 минут. Затем ее охлаждают и прибавляют к ней при помешивании 1,25 л дистиллированной воды. Раствор фильтруют через воронку Бюхнера и промывают метадинитробензол на фильтре абсолютным этанолом (1 раз – 60 мл и 2 раза – по 40 мл). Кристаллизацию следует осуществлять очень быстро, чтобы образовывались мелкие кристаллы, т. к. большие плохо растворяются в спирте. Полученные мелкие игловидные кристаллы должны иметь указанную температуру плавления. Спиртовой раствор метадинитробензола держат в темной склянке с притертой пробкой 8.метанол 9.хлороформ («для наркоза») 10.раствор формальдегида, 400 г/л (формалин). Раствор разводят в соотношении 1 : 5 дистиллированной водой. 11.стандартныерастворы кетостероидов, получаемые из кристаллических дегидроэпи андростерона и андростерона. Стандартные растворы готовят в концентрации 100 мкг/мл , для чего 5 мг дигидроэпиандростерона или андростерона растворяют в 50 мл абсолютного этанола. Хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой, эталон устойчив в течение нескольких месяцев. Ход определения: включает в себя несколько этапов.

1 этап . Гидролиз мочи. К помещенным в коническую (на 100 мл) колбу 20 мл мочи, взятой из ее суточного количества, прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида. Содержимое колбы перемешивают, накрывают ее воронкой и ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. После этого колбу охлаждают под струей холодной водопроводной воды и содержимое ее переносят в делительную воронку.

2 этап . Экстракция и очистка экстракта (осуществляется в делительной воронке). Экстракцию производят диэтиловым эфиром (2 раза по 10 мл) в течение 1 – 1,5 минут. Нижний слой мочи удаляют. Эфирные экстракты объединяют, промывают тремя порциями по 10 мл раствора едкого натра (по 3 минуты). Водную, содержащую эстрогены и другие вещества кислого характера, щелочную фазу убирают и экстракт промывают 1 раз 10 мл дистиллированной воды. Воду тщательно отделяют, эфирный экстракт порциями переносят в центрифужную пробирку и выпаривают на теплой (с температурой не выше 50 С) водяной бане. Сухие экстракты (при формальдегидном способе они должны быть бесцветны) на этом этапе можно оставить до следующего дня в холодильнике.

3 этап. Количественное определение по Циммерману в модификации Креховой.

К сухому остатку приливают 0,2 мл абсолютного этанола, 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 1 ч (в темноте!! !) при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 3 мл водного раствора этанола (500 г/л) и 2 мл хлороформа, смесь энергично встряхивают. Окрашенные в фиолетовый (лиловый) цвет продукты переходят в нижний, хлороформенный слой, а продукты с неспецифической окраской – желто – коричневой или коричневой – остаются в верхнем спиртоводном слое. Через пару минут верхний слой удаляют отсасыванием (пастеровской пипеткой). Делать это нужно аккуратно, тщательно собирая капли водного слоя со стенок пробирки, не засасывать хлороформенный слой.

В хлороформенный слой добавляют 1 мл абсолютного этанола. После перемешивания интенсивность окраски раствора измеряют на фотометре с зеленым (500 – 560нм) светофильтром в кювете на на 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы. Окраска стабильна в течение часа, а затем интенсивность ее снижается: через 1 ч она оказывается слабее уже на 10 – 15%. В связи с этим на одно определение допустимо брать не более 10 – 15 проб.

Приготовление контрольной пробы: в две пробирки прилить по 0,2 мл абсолютного этанола, по 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и по 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки перемешивают и деле обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику. Для получения данных к расчету по формуле параллельно опытным пробам через процедуру анализа пропускают 0,5 мл основного стандартного раствора, содержащего 50 мкг андростерона или дигидроэпиандростерона.

Для получения данных к построению калибровочного графика через все этапы анализа проводят стандартный раствор андростерона (дигдроэпиандростерона) в количестве от 0,1 до 1,0 мл основного раствора. Линейная зависимость сохраняется до концентрации стандартного раствора 100 мкг/мл (100 мг/л). Экскрецию 17 – КС с мочой рассчитывают по формуле:

Х (мг/сут) = А _оп * d * 50 /А _ст * 20 * 1000 = А _оп * d /А _ст * 400

50 – содержание (мкг) андростерона или дигидроэпиандростерона в стандартной пробе

d – диурез (мл/сут)

20 – количество взятой в опыт мочи (мл)

1000 – коэффициент перерасчета, используемый для перевода мкг в мг.

Расчет по калибровочному графику проводится с использованием формулы:

Х = С * d/ 20 * 1000

С – найденное по калибровочному графику содержание 17 – КС в пробе (мкг стандартного вещества андростерона или дегидроэпиандростерона). Для перевода полученного по формуле значения из мг в мкмоль его умножают на коэффициент 3,467.

При больших концентрациях 17 – КС в моче (свыше 100 мкг в пробе) дальнейшее исследование сводится к: