Отчет по практике: Постановка реакции ПЦР

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

1. ??????????, ?????? ? ??????? ??????????? ????????????????? ??????????? ??????2. ????????? ??? ?? ???????? ?????3. ?????????? ???4. ??? ???????5. ?????? ???-????????????????? ?????????????

ВВЕДЕНИЕ

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Къеллу Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кери Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний, используется для подбора гистосовместимого донора органов и тканей, регистрации всех потенциальных реципиентов, нуждающихся в тканевых и органных трансплантантах, проведения иммунологического контроля за приживлением пересаженных органов и тканей.

1. ??????????, ?????? ? ??????? ??????????? ????????????????? ??????????? ?????? 1. ????? ?????????.1.1. ??????????? ????????????????? ??????????? (??) ???????????? ? ??????? ??????? ??????????? ?????.1.2. ??????????? ?? ???????????? ???????????? ??????????? ???????????????? ???????????? ?????? ? ???????? ??????????? ?????????????? ???????????????? ??????????.1.3. ??????????? ?? ???????????? ????? ? ???????-????????????????? ???????????? ???? ? ????? ??????? ????????????????? ?????? ??????? ? ??????, ??????????? ???? ????????????? ???????????, ??????????? ? ???????? ? ???????? ???????????????, ?????????? ????????????????? ???????? ?? ???????????? ???????????? ??????? ? ??????.2. ???????? ?????? ??????????? ????????????????? ???????????: ??????????????-???????????? ??????????? ?? ??????????? ????????? ??????????? ? ???????-???????????????? ??????????? ???????????????? ????; ??????????? ?????, ???????????? ????????? ?? ??????? ????-HLA ???????; ???????????? ??????????? ??????? ?????? ??????? ? ?????????? ?????????????, ??????? ???????? ? ???????? ??????????????.3. ??????? ??????????? ????????????????? ???????????:3.1. ??????????? ???????????? ????? ?????? ????????????????? ???????????? ???????, ??????????? ? ???????-???????????????? ??????????? ??????????? ???????.3.2. ??????????? ????????? ?????????? ?????? ?????? ????????????? ??????? ???????? ? ???????? ?????????????? ? ???????????, ?????????? ????????? ???????????? ??????? ? ???????????, ???????????? ????? ??????????? ??? ?????-?????????.3.3. ???????? ?????? ? ???????? ????? ?? ????????????? ????? ?????????? ? ?????????? ?????????? ????? ?????? ? ??????????.3.4. ???????? ?????????? ????????????????? ???????? ?? ????????? ?????????????????? ??????? ? ???????????? ???????? ? ???????? ??????????????.3.5. ????????? ? ??????????? ?????? ?? ????????? ???????????? ??????????? ???????-???????????????? ?????????? ???? ?? ????????????????? ??????????? ??????.3.6. ?????????? ??????????????? ?????? ? ???????-???????????????? ??????????? ???? ?? ???????? ???????????? ???????? ???????????????? ????????????. 2. ????????? ??? ?? ???????? ?????

Перед выделением ДНК необходимо приготовить рабочий раствор солевого буфера. Для этого Содержимое флакона с 10-кратным Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом довести до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4˚С. Солевой буфер необходим для дальнейшей промывки осадка с ДНК.

Выделение ДНК проводят в специализированном боксе для выделения. Необходимо соблюдать правила техники безопасности:

- руки должны быть защищены одноразовыми перчатками, которые утилизируются после выделения;

- дыхательные пути защищены одноразовой маской, которая также подлежит утилизации после использования;

- лаборант во время выделения должен быть одет в специальный халат, шапочку и очки.

Все манипуляции с исследуемым материалом проводят при соблюдении правил работы с вирусами III и IV группы. Постановку ПЦР осуществляют как минимум в 3 рабочих зонах:

Зона 1 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка ПЦР-реагентов.

Зона 2 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка проб и контролей, выделение ДНК, внесение проб в пробирки с ПЦР-реагентами, проведение амплификации.

Зона 3: детекция амплифицированной ДНК.

Пробы из зоны 3 запрещено переносить в зоны 1 и 2 во избежание контаминации ДНК-матрицей. Пипетки или наконечники должны иметь аэрозольный барьер. Перчатки и халаты необходимо менять при переходе из одной зоны в другую.

Оборудование, необходимое для выделения ДНК:

– ламинарный бокс или стерилизуемое УФ-излучением помещение;

– одноразовая пластиковая посуда (стерильные пробирки типа "Эппендорф" объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл);

– автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл;

– сменные одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами;

– центрифуга типа "Эппендорф" с охлаждением и скоростью не менее 10000 g;

– встряхиватель ("Вортекс");

Выделение ДНК из венозной крови проводят в несколько этапов:

1. В пробирку объёмом 1,5 мл внести 300 мкл исследуемой пробы, добавить 800 мкл Лизирующего реагента и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Лизирующий реагент необходим для разрушения клеток крови и экстракции из них ДНК.

2. Термостатировать пробирку со смесью 5-7 мин. При температуре 65˚С. Если выделение ДНК проводится из твёрдого сухого мелкоизмельчённого материала, то следует термостатировать 30-40 мин.

3. После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 сек при 5000 об. в мин., в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворённый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.

4. В пробирку с чистой смесью добавить 45 мкл суспензии сорбента NucleoS^TM . Перед использованием NucleoS^TM следует интенсивно перемешать до гомогенной суспензии на вортексе. NucleoS^TM необходим для того, чтобы на его частицах осела выделенная из клеток ДНК.

5. Пробирку поместить на ротатор и перемешивать 10 мин (10-20 об/мин) для лучшего оседания выделенной ДНК на частицах кремния.

6. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--