Отчет по практике: Постановка реакции ПЦР

5. Анализ ПЦР-амплифицированной ДНК

Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез.

Материалы

- агароза;

- 0,5-кратный буфер для приготовления агарозного геля;

- ТБЕ-буфер для электрофореза.

Подготовка реагентов

- В колбу объемом 1 литр помещают 1,5 г агарозы, добавляют 150 мл 0,5-кратного буфера ТБЕ. Агарозу нагревают в микроволновой печи до полного расплавления.

- 20 мл концентрированного буфера ТБЕ разбавляют 480 мкл дистиллированной воды, получая буфер для электрофореза.

Оборудование

– прибор для вертикального электрофореза;

– источник питания (источник постоянного тока);

– трансиллюминатор;

– фото- или видеокамера с фильтрами для съемки в УФ;

– автоматические пипетки и наконечники.

Меры предосторожности и правила работы при постановке электрофореза

Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с использованием перчаток. Реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке.

Обезвреживание реагентов

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 M раствора калия перманганата и 1 объем 2,5 M соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4–6 ч. Затем добавляют 1 объем 2,5 M натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

Постановка

- в специальную ванночку с гребенками вносят расплавленный гель и дают остыть в течение получаса;

- после застывания агарозы гребенки аккуратно достают, стараясь не повредить образовавшиеся лунки, гель смачивают в буфере ТБЕ и помещают на специальную планшету;

- вносят 5 подготовленной пробы в луночки геля;

- гель помещают в ванночку для электрофореза и подключают к источнику тока.

Учет результатов

Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора. Продукты реакции амплификации выглядят в виде светящихся полос, наблюдаемых визуально в УФ-свете трансилляминатора. Результаты фиксируют посредством фотографирования или видеосъемки геля при использовании УФ-фильтров (рис. 2).

Рисунок 2. Фотография геля с продуктами реакции амплификации в УФ-свете трансиллиминатора