Цель работы состояла в изучении механизмов генерации АТФ - индуцированных внутриклеточных кальциевых сигналов в нервных клетках моторной коры.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Гомеостаз кальция в нервных клетках

Концентрация цитозольного кальция в эукариотических клетках регулируется трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция. Движение ионов кальция через мембрану контролируется: 1) двумя семействами Са²⁺ каналов, как то: кальциевыми каналами плазмалеммы и кальциевыми каналами, расположенными в мембране эндо(сарко)плазматического ретикулума (ЭР или СР), которые формируют пути входа кальция в цитоплазму; 2) выводом кальция из цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и/или кальциевых обменников; и 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и митохондриями. Последние служат системами кальциевого буфера, способными аккумулировать и накапливать ионы кальция, поддерживая таким образом гомеостаз кальция в цитоплазме.

2.1.1 Кальциевые каналы плазматической мембраны

Нервные клетки экспрессируют различные типы кальциевых каналов плазмалеммы, которые могут быть активированы различными воздействиями. Основываясь на механизмы активации, кальциевые каналы могут быть разделены на несколько типов потенциал - управляемых и рецептор - управляемых каналов.

Потенциал - управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию входа кальция в цитоплазму, так и в нейрональный электрогенез. Белки, образующие кальциевые каналы, состоят из 5 субъедениц (a₁ , a₂ , b, g, d). Главная субъеденица a₁ формирует собственно канал и содержит места связывания для различных модуляторов кальциевых каналов. Было обнаружено несколько структурно различных a₁ субъедениц кальциевых каналов в нервных клетках млекопитающих (обозначенных как A, B, C, D и E). Функционально кальциевые каналы различных типов отличаются друг от друга активацией, кинетикой, проводимостью одиночного канала и фармакологией. В нервных клетках описано до 6 типов потенциал - управляемых кальциевых каналов (T-, L-, N-, P-, Q-, R- каналы). Активность потенциал - управляемых каналов плазмалеммы регулируется различными внутриклеточными вторичными посредниками и мембраносвязанными G-белками (33,26).

Второй важный путь потока ионов кальция через мембрану связан с активацией агонист - управляемых каналов . Многие агонист - управляемые каналы обладают значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях. Такую кальциевую проницаемость обнаруживают нейрональные ацетилхолин(Ach)-управляемые, глутамат -управляемые (NMDA и AMPA/Каинат типы) и пуринорецепторы (10,18,49,34). Кроме кальциевых каналов плазмалеммы, управляемых внешними воздействиями, в эукариотических клетках было открыто также несколько типов кальциевых каналов, контролируемых внутриклеточными вторичными посредниками. В частности, IP₃ -управляемые кальциевые каналы были обнаружены в нейронах Пуркинье мозжечка (34), а IP₄ -управляемые кальциевые каналы - в клетках эндотелия (35).

Третий, недавно обнаруженный, особый тип Са²⁺ каналов, который контролируется заполненностью внутриклеточных кальциевых депо, осуществляя таким образом прямую связь между освобождением Са²⁺ в цитоплазму из депо и вход в нее Са²⁺ через плазмалемму.

2.1.2 Кальциевые буферы

Большая часть ионов Са²⁺ , входящих в клетку, практически немедленно связывается цитоплазматическими местами связывания кальция. Показано, что только менее 1% ионов кальция, которые проникают в цитозоль, остается в несвязанном состоянии (11). Цитозольные кальциевые буферы представлены главным образом Са²⁺ -связывающими белками, такими как парвальбумин, кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, белок S-100 (25). Кроме того, цитозольная буферная емкость может быть опосредована АТФ, которая способна связывать значительное количество Са²⁺ (64). 20-50% цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при перфузировании клетки, что показывает их мобильность, в то время как оставшаяся часть Са²⁺ -связывающей емкости относится к фиксированным буферам. Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль, способствуя диффузии ионов Са²⁺ в цитоплазме и распространению Са²⁺ сигнала по клетке. Внутриклеточное введение эндогенных Са²⁺ буферов (кальбиндина D_28k и парвальбумина) через микропипетку приводило к увеличению скорости нарастания [Ca²⁺ ]_i на несколько порядков и существенно влияло на кинетику изменения [Ca²⁺ ]_i , что подтверждает роль мобильных Са²⁺ буферов с низким молекулярным весом в эффективном регулировании внутриклеточной концентрации кальция.

2.1.3 Кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума

Са²⁺ каналы ЭР являются олигометрическими протеинами, встроенными в мембрану ЭР. Эти каналы можно относительно легко выделить из клетки для дальнейшего структурного анализа благодаря тому, что белки канала связываются специфически и с высоким сродством с IP₃ (для IP₃ -управляемых каналов) и с рианодином (для Са²⁺ -управляемых каналов).

Са²⁺ -управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Эти кальциевые каналы были впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. Оказалось, что Са²⁺ каналы ЭР в этих мышечных тканях имеют молекулярные различия и закодированы различными генами. Са²⁺ каналы ЭР в сердечных мышцах непосредственно связаны с высокопороговыми Са²⁺ каналами плазмалеммы (L-тип) через кальцийсвязывающие белки, образуя, таким образом, функционально активную структуру - «триаду». В скелетных мышцах деполяризация плазмалеммы прямо активирует освобождение Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума благодаря тому, что Са²⁺ каналы плазмалеммы служат потенциал - чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са²⁺ каналам ЭР через связывающие белки (44). Таким образом, Са²⁺ депо скелетных мышц обладают механизмом освобождения Са²⁺ , вызываемым деполяризацией (RyR1-тип). В отличие от скелетных мышц, саркоплазматические Са²⁺ каналы кардиомиоцитов не связаны с плазмалеммой, и для стимуляции освобождения Са²⁺ из депо требуется увеличение концентрации цитозольного кальция (RyR2-тип). ДНК, кодирующая белки двух типов каналов Са²⁺ освобождения, была клонирована из тканей человека и кролика, что дало возможность экспрессировать Са²⁺ -управляемые Са²⁺ каналы в модельные клеточные системы. Белки, встроенные в липидный бислой, формируют чувствительные к рианодину каналы, активируемые ионами Са²⁺ (50 нмоль/л) в присутствии АТФ (29). Кроме этих двух типов Са²⁺ -активируемых Са²⁺ каналов, недавно был идентифицирован третий тип Са²⁺ каналов ЭР (RyR3-тип), который является продуктом другого гена. Этот третий тип Са²⁺ каналов ЭР, как было показано, не чувствителен к кофеину (21). Эксперименты, проведенные на нервных тканях, продемонстрировали присутствие всех трех типов Са²⁺ -управляемых Са²⁺ каналов ЭР в мозге млекопитающих, однако RyR2-тип является доминантным (38). Са²⁺ -управляемые Са²⁺ каналы ЭР являются гомотетрамерами, состоящими из мономеров с молекулярным весом 500 КД (39)

IP₃ -управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Существование IP₃ -управляемых Са²⁺ каналов впервые было обнаружено в нейронах Пуркинье. Позже было показано, что они встроены в мембрану эндоплазматического ретикулума. Структура IP₃ -управляемых Са²⁺ каналов сходна со структурой Са²⁺ -управляемых Са²⁺ каналов ЭР. Они также являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономера 260 КД. 50% этих каналов активируется 15 мкмоль/л IP₃ и блокируется рутением красным и La³⁺ . IP₃ -управляемые Са²⁺ каналы были выделены из мозга млекопитающих, и их аминокислотная последовательность была расшифрована. Было показано, что семейство генов, экспрессирующих IP₃ -управляемые Са²⁺ каналы, состоит из трех или четырех различных генов; они характеризуются различной чувствительностью к IP₃ и по-разному распределены в мозге млекопитающих (45). Порог активации этих каналов варьирует между 0.2 - 0.5 мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9 мкмоль/л в астроцитах.

2.1.4 Кальциевые насосы

Существует два семейства Са²⁺ насосов, ответственных за устранение ионов Са²⁺ из цитоплазмы: Са²⁺ насосы плазмалеммы и Са²⁺ насосы эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному семейству белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают некоторые различия в строении, функциональной активности и фармакологии.

Кальциевый насос плазмалеммы. Са²⁺ насос плазмалеммы, который удаляет ионы Са²⁺ из цитоплазмы в межклеточное пространство, был открыт в 1966 году. Молекулярные свойства Са²⁺ насосов плазмалеммы описаны в нескольких обзорах (18), однако достоверных данных о скорости вывода Са²⁺ и регуляции Са²⁺ насосов в нервных клетках немного. Недавно был разработан двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58), позволяющий одновременно измерять [Ca²⁺ ]_i и выход Са²⁺ наружу на одиночных клетках. Исследования, проведенные с помощью данного метода на нейронах моллюска и секреторных клетках, показали, что активность Са²⁺ насоса плазмалеммы контролируется непосредственно [Ca²⁺ ]_i : увеличение концентрации цитоплазматического кальция активирует Са²⁺ насос (58). В нейронах моллюска около 40% ионов кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca²⁺ ]_i , отражая таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации цитозольного Са²⁺ (58).

Кальциевый насос эндоплазматического ретикулума. Во многих эукариотических клетках, наряду с Са²⁺ насосом плазмалеммы, существует кальциевый насос сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA). В настоящее время описано по крайней мере 3 различных изоформы SERCA-насосов в клетках млекопитающих. SERCA1-подтип сосредоточен исключительно в быстрых скелетных мышцах, SERCA2-насосы широко распространены в других тканях. Значимость SERCA3-насосов менее ясна (13). Белки SERCA2-насосов разделяются на две различные изоформы: SERCA2а, характерные для кардиомиоцитов и гладких мышц, и SERCA2b, характерные для тканей мозга. Предполагается, что насосы SERCA различными способами регулируются цитоплазматической и интралюминальной концентрациями Са²⁺ : Увеличение [Ca²⁺ ]_i активирует захват ионов кальция в ЭР, в то время как увеличение свободного кальция внутри ЭР ингибирует насосы SERCA (12). Насосы SERCA эффективно и селективно блокируются тапсигаргином в наномолярных концентрациях (37) и микромолярными концентрациями циклопиазоновой кислоты. Однако, тапсигаргин вызывает также блокаду потенциал - управляемых кальциевых каналов плазмалеммы, как это показано на клетках коркового слоя надпочечников и на сенсорных нейронах (Shmigol et al., 1995 ), поэтому его следует использовать с некоторой осторожностью.

2.1.5 Кальциевые обменники

Дополнительным механизмом, ответственным за вывод ионов кальция из цитоплазмы, является натрий-кальциевый обменник, который выводит Са²⁺ , используя энергию натриевого электрохимического градиента. Наличие Na⁺ - Са²⁺ обменника было показано в различных типах возбудимых и невозбудимых клеток; в клетках нервной системы он был обнаружен в конце 60-х годов (9). В нейронах моллюска, помещенных в среду с пониженным натрием (т.е. с обратным натриевым градиентом), наблюдалось увеличение [Ca²⁺ ]_i , что является результатом работы обменника в инвертированной форме. Однако, вклад Na⁺ - Са²⁺ обменника в регуляцию [Ca²⁺ ]_i в нейронах млекопитающих до сих пор не оценен. В некоторых работах было показано, что обменник принимает незначительное участие в удалении цитоплазматического Са²⁺ , в то время как в других работах представлены данные о том, что обменник играет существенную роль в переносе Са²⁺ через мембрану (57).

2.1.6 Са²⁺ -связывающие органеллы

Кроме быстрого связывания цитозольного Са²⁺ внутриклеточными Са²⁺ -связывающими белками, ионы кальция, попадающие в цитозоль, могут аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром, захватываться митохондриальными Са²⁺ депо, имеющими достаточно невысокое сродство к Са²⁺ , или быстрыми депо, связанными с ЭР или СР, имеющими высокое сродство к Са²⁺ . Однако если [Ca²⁺ ]_i превышает 0,5 мкмоль/л, наблюдается существенное перераспределение [Ca²⁺ ]_i в область митохондрий. Буферные системы митохондрий принимают участие в удалении избыточного Са²⁺ из цитоплазмы в клетках кишечника, некоторых типах нервных клеток (59) и в секреторных клетках после повышения [Ca²⁺ ]_i , стимулированного агонистами. Связывание кальция митохондриями обеспечивается активностью систем, расположенных на внутренней митохондриальной мембране. Са²⁺ поступает в митохондрии по электрохимическому градиенту; разность потенциалов, обеспечивающая транспорт кальция, создается переносом электронов во время клеточного дыхания и связанного с ним переносом протонов. Перенос электронов по дыхательной цепи является основным механизмом, обеспечивающим энергетику транспорта кальция. Подавление дыхательной цепи карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном (СССР) эффективно блокирует аккумуляцию кальция митохондриями (41).

2.2 Влияние АТФ на кальциевый гомеостаз

Последние исследования показали, что АТФ занимает прочное место в ряду нейромедиаторов центральной и периферической нервной систем (Burnstock 1990). Не вызывает сомнения, что АТФ является не только важнейшим внутриклеточным метаболитом, но и служит важным объектом межклеточного взаимодействия.

2.2.1 Строение и свойства АТФ

Рисунок 1. Строение молекулы АТФ

АТФ (см. рис.1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, сахара пентозы и фосфата. В качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина и пиримидина. Фосфаты соединены в полифосфатную цепь, количество которых в естественных нуклеотидах не превышает трех. Однако синтезированы нуклеотиды, содержащие линейные цепи из более чем 3-х фосфатов, к примеру аденозинтетра- и аденозинпентафосфаты.

Названия нуклеотидов, содержащих в качестве сахара рибозу, складываются из названия соответствующего нуклеозида, приставки, обозначающей количество фосфатных групп в нуклеотиде и слова фосфат. Для наиболее распространенных нуклеотидов приняты сокращенные названия, например АТФ для аденозинтрифосфата, ГТФ - для гуанозинтрифосфата, ИМФ - инозинмонофосфата.

В области нейтральных значений pH нуклеиновые основания и рибоза в растворе не заряжены (Мартин, Мариам, 1982). Нуклеотиды, из-за наличия фосфатов, представляют собой сильные кислоты. АТФ содержит четыре ОН группы, способные к ионизации, три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa четвертой - 6,5 (Ленинджер, 1976). Таким образом, при pH 7,4 подавляющее большинство молекул АТФ представляют собой четырехзарядные анионы АТФ^4- , кроме того, в растворе присутствует небольшое количество АТФ^3- .

2.2.2 Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов.

Первое разделение пуринорецепторов на Р₁ и Р₂ типы основывалось на следующем критерии: нуклеозиды такие как аденозин активировали Р₁ пуринорецепторы, в то время как АТФ стимулировала Р₂ пуринорецепторы, а метилксантины (кофеин, теофиллин) являются селективными антагонистами Р₁ пуринорецепторов. Также Р₁ пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой, а активация Р₂ пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов (Burnstock 1978).

2.2.3 Р ₁ пуринорецепторы.

В 1979 году (Van Calker et al 1979) показали, что аденозиновые, Ð₁ - пуринорецепторы можно подразделить на две группы. Рецепторы одной из них обладали очень высоким сродством к аденозину (константа диссоциации К_d = 3 - 10 нМ). При взаимодействии аденозина с этой группой рецепторов наблюдалось ингибирование аденилатциклазы и, следовательно, уменьшался уровень внутриклеточного цАМФ. Этот класс рецепторов был назван А₁ -рецепторами (R_i рецепторы по (Londos et al 1980)). Аденозиновые рецепторы, относящиеся ко второй группе, имели более низкое сродство к аденозину (К_d комплекса аденозина с рецептором 5-10 мкМ). Активация этого типа рецепторов приводила к стимуляции аценилатциклазы. Эти рецепторы Ван Колкер назвал А₂ -рецепторами (R_a рецепторы по (Londos et al 1980)). Были обнаружены также и мощные антагонисты для А₁ - R-N⁶ -Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А₂ более сильным антагонистом был 5’-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Также существуют работы, в которых описываются аденозиновые рецепторы, не связанные с аденилатциклазой эти пуринорецепторы было предложено назвать А₃ (Ribeiro and Sebastiao 1986). Предпосылкой к разделению А₂ пуринорецепторов на А_2а и А_{2 b} подтипы стало открытие разного сродства NECA к Р₁ пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А_2а ) и низкого в фибробластах (А_{2 b} ) (Bruns et al 1986).

2.2.4 Р₂ пуринорецепторы

Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными аналогами, послужили основой для первого субделения Р₂ пуринорецепторов. В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность популяции Р₂ -пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того, что в некоторых тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал расслабление гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) - сокращение. Первый подтип рецепторов был обозначен как Р_2у , а второй - Р_2х . Для Р_2х пуринорецепторов наиболее активным агонистом был a, b - метилен АТФ (a,b-мАТФ), а для Р_2у - 2 - метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности лигандов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений, которая может значительно различаться в зависимости от ткани, более четким доказательством для подразделения Р₂ - рецепторов на подтипы служит наличие селективных блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р_2х , так и Р_2у -рецепторов для Р_2х - a,b-мАТФ (десенситизирующее действие), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП₃ ), пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и другие; для Р_2у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин. В 1986 году Гордон (23) предложил выделить из класса Р₂ пуринорецепторов еще два подтипа Р_{2 t} и Р_2z . Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в отличие от всех остальных подтипов P₂ - рецепторов, активируется АДФ, и блокируется АТФ. Р_{2 z} рецепторы расположены в тучных клетках. В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ), а точнее четырехзарядный анион АТФ^4- , вызывал кальцийзависимую секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая негидролизуемые аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен неселективный антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). В 1991 году O’Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот рецептор получил обозначение Р_{2 u} . Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин. Также было обнаружено, что аденин динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии (Hoyle 1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин тетрафосфата ( Ap₄ A) в мозге крысы, который получил название дипуринергического рецептора, а позднее Р_{2 d} (Pintor et al 1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены.

пуринорецепторы

Р1 - пуринорецепторы

Р2 - пуринорецепторы

A1

A2a

A2b

A3

P2x

P2y

P2t

« 1 2 3 4 » К-во Просмотров: 212 Бесплатно скачать Реферат: Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс >>> Скачать <<< Меню Поиск