Реферат: ДНК-діагностика та її застосування у ветеринарії

Зміст

Вступ

1. ПЛР – основний метод ДНК - діагностики

2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції

3. Переваги ПЛР - діагностики інфекційних захворювань тварин

Висновки

Список використаних джерел

Вступ

Інфекційна патологія у ветеринарії охоплює широке коло хвороб, різних як по характеру течії (гострі, хронічні, латентні), ступені розповсюдження (від спорадичних випадків до епізоотії), так і по складності їх діагностики. Важливе, а при деяких хворобах вирішальне значення мають серологічні дослідження, направлені на виявлення антитіл, що виробляються організмом тварини у відповідь на впровадження інфекційного агента або вакцини. Не дивлячись на ряд переваг, методи, засновані на цьому принципі, володіють недостатньою чутливістю і специфічністю. Істотний прорив був зроблений останніми роками, коли для діагностичних цілей привернули методи генної інженерії і біотехнології. Для діагностики інфекційних захворювань найбільшого застосування знайшов спосіб ампліфікації (множення) нуклеїнових кислот: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), лігазна ланцюгова реакція, NASBA-метод та ін [1].

Метою даної роботи було виявити основні переваги і ефективність методу ДНК-діагностики, а також впровадження його в систему державної ветеринарної служби.

У роботі були поставлені наступні завдання:

- дати комплексну оцінку методу ПЛР-діагностики;

- визначити переваги ПЛР-діагностики інфекційних захворювань;

- розглянути деякі види патологій тварин, при яких цей метод грає важливу роль.

1. ПЛР – основний метод ДНК-діагностики

ПЛР в лабораторній діагностиці інфекцій характеризується швидкістю, неперевершеною чутливістю і високою специфічністю, що дозволяє виявляти мікроорганізми, присутні в дуже низьких концентраціях (1-10 збудників в пробі). При цьому ДНК інфекційних агентів може бути достатньо ефективно екстрагована з будь-якої біологічної рідини або тканини, а також з проб об'єктів навколишнього середовища (грунти, води і так далі) і продуктів харчування. Полімеразна ланцюгова реакція ефективна при виявленні бактерійних, грибкових, паразитарних і вірусних патогенів.

Одним словом, це метод, заснований на принципі ампліфікації, — ізольованого множення гена або його певного фрагмента. Ампліфікація — один із способів виживання мікроорганізмів і клітин тварин в умовах дії протипухлинних і протибактерійних препаратів. ПЛР дозволяє проводити аналогічний процес in vitro, тобто в пробірці.

Основні положення ампліфікації ДНК in vitro були обгрунтовані співробітником корпорації "Cetus" (США) Кері Маллісом в 1983 році. Через 10 років за цю розробку він був удостоєний Нобелівської премії по хімії.

Метод базується на добудові ферментом (термостабільна ДНК-полімераза) олігонуклеотидных затравок (праймерів), приєднаних до денатурованої низькокопійованій ДНК-матриці. Праймери визначають специфічність реакції і величину фрагмента. Процес ампліфікації включає багатократне повторення певних циклів, як правило, 30-40. Кожен складається з трьох основних стадій: денатурація ДНК, відпалу (приєднання) і добудови праймерів.

На першій стадії дволанцюгова ДНК-матриця денатурується при 94°С з утворенням одноланцюгових ДНК. На другій температура знижується до 55-65° С і відбувається приєднання праймерів до кожної з двох одноланцюгових ДНК. На третій фермент (термостабільна ДНК-полімераза) при температурі 72° С добудовує обидва праймери в напрямі від 3-го до 5-го кінця, внаслідок чого утворюється дволанцюгова ДНК.

Після першого циклу створюються довгі фрагменти, оскільки полімераза добудовує праймери, використовуючи як матрицю весь геном. У наступних циклах праймери відпалюють із знов синтезованими молекулами ДНК. Полімераза зупиняється, доходячи до кінця цих молекул, тобто до праймерів, використаних в попередньому циклі. Після кожного циклу число молекул матриці подвоюється, в результаті відбувається експоненціальна ампліфікація фрагмента ДНК-матриці. Це дозволяє за 25-40 циклів накопичити ПЛР-продукт в достатній кількості для візуальної детекції після електрофоретичного розділення і фарбування бромистим етидієм [1].

Основні компоненти ПЛР

1. Два синтетичних олігонуклеотидних праймера (завдовжки приблизно по 18-25 нуклеотидов). Кожен з них комплементарний одному з ланцюгів матриці, що обмежує початок і кінець ампліфікуючої ділянки. Специфічність реакції в основному визначається температурою відпалу праймерів, при якій відбувається їх комплементарна взаємодія з ДНК-матрицею. Температура залежить від довжини праймера і змісту G-C пар (З — гуанин, З — цитозин). Як правило, вона варіюється в діапазоні 50-64° С. Дизайн праймерів здійснюється з використанням спеціальних комп'ютерних програм і автоматичного ДНК-синтезатора.

2. Термостабільна ДНК-полімераза— фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів, — Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woe-sei (Pwo-полімераза) та інші.

3. Дезоксинуклеотідтріфосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

4. Іони Mg2+, необхідні для активації полімерази.

5. Буфер, що створює оптимальні умови для функціонування ферменту. Як правило, використовується Тріс-hci буфер, який утримує рН реакційного середовища в межах 7,8. Для стабілізації ферменту в середовище додають желатин або бичачий сироватковий Альбумін, неіонні детергенти (Твін-20, Тритон Х-100 і ін.) [3].

Створення ампліконів необхідної довжини починається з 3 до 25 циклів і носить експоненціальний характер. Через виснаження дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймери, інактивацій Taq-полімерази, зростання конкуренції ампліконов у ферменті, починаючи з 40-45 циклів реакція виходить на плато. Звідси, як правило, при постановці реакції число циклів не перевищує 30-35.

ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1° С. Зазвичай в нім можна задавати складні програми, зокрема можливість "гарячого старту" (Touchdown ПЛР) і подальше зберігання ампліфікованих молекул при 4° С. Для реакції в реальному часі випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. З тих, що поставляються зарубіжними фірмами найбільш популярні ампліфікатори фірм "Перкин-ельмер", "Еппендорф" і "Хайбенд".

В даний час розроблені вітчизняні прилади: "Цикло-темп", "Медімакс", "Термоцик", "Амрly 4L" та ін.

2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції

Вона складається з трьох основних процедур: пробопідготовки, яка в основному зводиться до виділення ДНК або РНК, постановки ПЛР і детекції ампліфікованого продукту.

Виділення нуклеїнових кислот (ДНК, РНК). Досліджуваним матеріалом для ПЛР можуть слугувати будь-які, навіть гістологічні препарати. Визначення можна проводити, використовуючи як клінічний і патологоанатомічний матеріал, так і проби з об'єктів зовнішнього середовища.

Залежно від виду визначеного збудника і клінічної проби застосовують різні способи виділення ДНК (РНК). В деяких випадках обробка полягає в додаванні агента, що лізирує, містить розчин гуанидинтиоционата, з подальшою сорбцією ДНК (РНК), багатократного відмивання і елюції, очищеної нуклеїнової кислоти.

В інших випадках необхідна депротеїнізація фенолом/хлороформом з подальшим осадженням ДНК (РНК) етанолом або ізопропанолом. Останніми роками ряд вітчизняних фірм ("Літех", "ДНК-технологія", "Діалат" і ін.) проводять набори для екстракції ДНК і РНК з різних клінічних зразків.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--