Реферат: ДНК-діагностика та її застосування у ветеринарії
Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфата, побічного продукту приєднання нуклеотидтрифосфатов до ланцюга ДНК, що росте, до ортофосфату.
Оброблену клінічну пробу вносять під масло в об'ємі 5-10 мкл. Ампліфікація проводиться в програмованому термостаті в автоматичному режимі за програмою, відповідно виду визначеної інфекції. Як правило, необхідно 1,5-3 години залежно від заданої програми.
При постановці реакції проводиться відповідний контроль: позитивний — препарату ДНК досліджуваного збудника; негативний — деіонізованої води. Останній необхідний для перевірки реакційної суміші на наявність контамінації продуктами ампліфікації (ампліконами).
В одній реакції ампліфікації можливе визначення декількох інфекцій (Multiplex PCR). З цією метою в реакційну суміш додають декілька пар праймерів, проте при цьому зменшується кількість води. Враховуючи, що чутливість реакції знижується пропорційно розбавленню, рекомендується одночасно визначати не більше 3 інфекцій.
Для визначення РНК-вмісних вірусів у складі реакційної суміші додатково вносять зворотну транскриптазу і інгібітор рибонуклеази (RT-PCR).
Ефективність ПЛР залежить від багатьох чинників, зокрема від кількості ДНК-матриці, якості Taq-полимеразы і дезоксинуклеотидтрифосфатів, специфічності праймерів, концентрації Мд2+ і програми ампліфікації. Для отримання максимального ефекту проводять оптимізацію реакції. У таблиці наведені межі варіації її основних параметрів.
Чутливість ПЛР істотно залежить від температури відпалу праймерів. При заниженій підвищується вірогідність ампліфікації неспецифічних фрагментів, при підвищеній знижується вихід ампліфікованого продукту, оскільки праймери слабо взаємодіють з ДНК-матрицею.
| Параметр | Діапазон варіацій | Градієнт варіацій |
| Концентрація Mg2+ | 1,5-3,0 mM | 0,25 mM |
| Кількість Taq-полимеразы в пробірці | 0,5-3,0 ед. | 0,5 ед./100 мкл |
| Концентрація кожного праймера | 0,2-2,0 мкМ | 0,5 мкМ |
| Температура відпалу | 45-64° З | 2-3° З |
Насьогодні розроблений ряд підходів, що підвищують специфічність реакцій. Часто з цією метою застосовується так звана "Nested PCR" (гніздова ПЛР). Принцип даного методу полягає у використанні двох пар праймерів, одна з яких здатна ампліфікувати внутрішню ділянку амплікона, отриманого після першого раунду, із зовнішньою парою праймерів. Застосування гніздової ПЛР має переваги: висока чутливість методики; відсутність необхідності використовувати інші методи. До недоліків відносять перенесення продуктів реакції з однієї пробірки в іншу, що істотно знижує концентрацію інгібіторів, а також приводить до появи великої кількості псевдопозитивних результатів внаслідок перехресної контамінації проб продуктами ампліфікації.
Останніми роками для підвищення чутливості і специфічності реакції використовується "гарячий старт". Суть його полягає в тому, що перш ніж додавати Taq-пoіимеразу, реакційна суміш прогрівається заздалегідь до 95° С. Це виключає можливість утворення неспецифічних фрагментів внаслідок неспецифічного відпалу праймерів при температурі нижче оптимальною.
Механізм простої полімеразної ланцюгової реакції непридатний для ідентифікації рибонуклеїнових кислот (РНК), оскільки Taq-noлимераза нездатна каталізувати синтез ДНК на матриці РНК. Разом з тим добре відомо, що геноми багатьох вірусів складаються з молекул рибонуклеїнових кислот (РНК), і внаслідок цього актуальна ідентифікація РНК-вірусів. Практично це вирішується за допомогою декількох прийомів, зокрема використання додаткового ферменту — РНК-залежної ДНК-полімерази — зворотної транскриптазы (RT — reverse transcriptase). Реакція, що каталізується цим ферментом, приводить до утворення одноланцюгових фрагментів ДНК, використовуваних надалі в ампліфікації за допомогою Taq-полимеразы.
Як було відмічено вище, Taq-полімераза нездатна каталізувати процес зворотньої транскрипції, тобто синтез одноланцюгової ДНК на РНК-матриці. У 1991 році Маєрсом і Гельфандом охарактеризований фермент ДНК-залежної ДНК-полімерази, виділеної з іншого екстремального термофілу Thermus thermophilus (Tth-полиме-раза), який у присутності іонів магнію і хелаторов іонів марганцю дозволяв ферменту каталізувати звичайну ДНК-залежну ДНК-полімеразну реакцію. Цей фермент міг бути використаний для одночасного синтезу комплементарних одноланцюгових фрагментів ДНК і ампліфікації.
Реєстрація результатів. В більшості випадків ампліфікований фрагмент ДНК або кДНК виявляють методом електрофорезу в 1,5-2% гелю агарози у присутності бромистого етидія, який утворює з фрагментами ДНК стійкий комплекс. При опромінюванні гелю ультрафіолетом довжиною хвилі 290-330 нм ампліфіковані фрагменти ДНК виявляються у вигляді смуг, що світяться.
Специфічність смуги визначається її положенням по відношенню до ДНК-маркера і позитивного контролю.
Специфічність ампліфікованого фрагмента також може бути підтверджена рестрикційним аналізом або гібридизацією із специфічним міченим флуоресцентним або радіоактивним зондом.
Інші методи детекції засновані на ідентифікації мічених компонентів реакції. Зокрема, в окремих тест-системах (фірми "Хофманн Ля Рош") використовуються праймери, мічені биотином. В процесі детекції амлікон, мічений биотином, гібридизуєтся із специфічним ДНК-зондом, іммобілізованним на мікропланшеті. Активність ферменту, що входить в комплекс ампликон-биотин-авидин-пероксидаза хріну, виявляють прийомом, використовуваним при стандартному іммуноферментном аналізі. Інтенсивність забарвлення визначають на планшетному фотометрі при 450 нм. Даний підхід дозволяє проводити об'єктивну оцінку результатів реакції у вигляді показників оптичної щільності і, отже, кількісно визначати концентрацію ДНК або РНК в пробі.
Полімеразна ланцюгова реакція — високочутливий специфічний метод. Нажаль, він не виключає можливої контамінації.
Попадання в реакційну пробірку слідів ДНК або кДНК збудника (специфічних продуктів ампліфікації; ДНК-стандарту, використовуваного як позитивний контроль; ДНК або кДНК збудника клінічного зразка) приводить до ампліфікації в процесі реакції специфічного фрагмента ДНК і, як наслідок, до появи псевдопозитивних результатів.
Небезпеку представляють в основному два види контамінації: перехресна — від проби до проби (в процесі обробки клінічних зразків або розбризкування реакційної суміші), що приводить до появи спорадичних псевдопозитивних результатів; і продуктами ампліфікація (ампликоны), яка є також причиною отримання псевдопозитивних результатів. В процесі проведення ПЛР ампликоны накопичуються у великих кількостях і є класичними матрицями для реампліфікації.
Розрізняють і контамінацію слідами ампліконами посуду, автоматичних піпеток і лабораторного устаткування, поверхні лабораторних столів.
На підставі досвіду ПЛР-лабораторий до теперішнього часу сформульовані основні принципи організації діагности, що виключають можливість контамінації і отримання псевдопозитивних результатів.
Необхідно розділити різні стадії проведення аналізу, розміщуючи їх в окремих приміщеннях: для виділення ДНК або РНК; для проведення детекції продуктів ампліфікації.
Клінічні зразки необхідно поміщати тільки в одноразові стерильні пластикові пробірки. Робота повинна проводитися в лабораторному одязі, що змінюється при переході з одного приміщення в інше. Бажано, щоб на кожному етапі проведення реакції працювали інші співробітники.
На різних стадіях аналізу слід мати окремі набори напівавтоматичних піпеток.
Використовувати тільки одноразові матеріали, наконечники для мікропіпеток, пробірки, рукавички і так далі. Бажано застосовувати наконечники з аерозольним фільтром, що оберігає попадання мікрокрапель розчину в піпетку. Після роботи пробірки і наконечники повинні скидатися в дезинфікуючий розчин (1Н соляної кислоти, 10% гипохлорида натрію, 10% хлорною винищити).
Опромінювання робочих поверхонь проводять протягом 1 години до початку і після досвіду (випромінювання до 260 нм).
В даний час успішно застосовують метод ферментативного попередження контамінації. Суть його полягає в тому, що замість одного з 4 дНТФ, а саме замість дТТФ (дезокситимідинтрифосфат) вводиться аналог дУТФ (дезоксиуридинтрифосфат), який включившись в ампліфікон замість дТТФ, робить цей ампліфікон чутливим до ферменту урацил-глікозилази, яка також вводиться в ампліфікациону суміш. Деякі комерційні ПЛР-тест-систеи містять ці компоненти і тому гарантують відсутність псевдопозитивних результатів від контамінації. Подібну систему захисту мають ряд тест-систем, що випускаються зарубіжними фірмами, зокрема фірмою "Хофманн Ля Рош" [1].
3. Переваги ПЛР-діагностики інфекційних захворювань тварин
Метод дозволяє досягти гранично можливої чутливості: від одного до декількох збудників в пробі. Специфічність методу складає 99-100 відсотків. Для ПЛР-аналіза придатний будь-який матеріал, у тому числі і гістологічні препарати. Кількість досліджуваного матеріалу, як правило, складає декілька десятків мікролітів. Висока чутливість методу дозволяє контролювати ефективність лікування, що проводиться. ПЛР успішно використовується при діагностиці важкокультивованих і некультивованих збудників, а також хронічних, латентних і персистентных форм інфекції. Тривалість аналізу не перевищує 5-6 годин.
Але разом з перевагими є певний недолік, який можна охарактеризувати як технологічний. Маються на увазі підвищені вимоги до оснащення лабораторії, якості тест-наборів і строге дотримання регламенту дослідження щоб уникнути отримання помилкових результатів. Вирішення проблеми якості аналізів можливо при відповідній кваліфікації персоналу і обов'язкової сертифікації лабораторії.