Реферат: Дослідження антивірусної активності 6-азацитидину та амізону в модельній системі: цитомегаловірус - культура клітин фібробластів легень ембріона людини

Рис. 6. Анти-ЦМВ активність 6-azaC у терапевтичній схемі

по осі ординат- % пригнічення

формування включень від контролю вірусу,

по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл

Рис. 7. Анти-ЦМВ активність 6-azaC у профілактичній схемі.

по осі ординат- % пригнічення формування включень від контролю вірусу,

по осі абсцис – концентрація 6-azaC, мкг/мл

Дослідження впливу 6-azaC на синтез вірусних білків показав, що у концентраціях 100 мкг/мл і 1000 мкг/мл число клітин інфікованих ЦМВ, що містили білки р72 і рр65 у присутності сполуки 6-azaC практично не відрізнялось як від контрольної популяції клітин, так і від культури, обробленої ганцикловіром.

Структурний білок gВ був зареєстрований у 2,5% клітин контрольної культури через три доби після зараження, у той час як у клітинах оброблених 6-azaC у концентраціях 1000 мкг/мл і 3000 мкг/мл кількість клітин, що ситезували gВ складало 1% і 0,5% відповідно. Максимальне розходження результатів у числі клітин, що синтезували gВ, було відзначено на п’яту добу після зараження, коли число клітин, що містили вірусний білок у необробленій популяції було у 10 разів більше, ніж у досліді. Під дією 6-azaC і ганцикловіру нагромадження пізнього структурного білку gВ було знижено приблизно однаковою мірою.

Таким чином було встановлено, що (СD50)6-azaC, що не спричиняла незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин на 3-ю добу складала – 24000 мкг/мл, а концентрація препарату що на 50% пригнічувала синтез ДНК (CD50) становила - 2400 мкг/мл. 50% ефективна доза (ЕD₅₀ ) у терапевтичній схемі застосування при ІМ 0,001 БУО/кл відповідала 100 мкг/мл, при ІМ 0,0001 БУО/кл – ED₅₀ - 50 мкг/мл. Індекс селективності (ІS) для 6-azaC в залежності від множинності інфікування складав 48-240.

Оцінка анти-ЦМВ активності амізону. Цитотоксичність амізону за дією на життєздатність клітин вивчали використовуючи сполуку у концентраціях 0,1 мкг/мл - 1000 мкг/мл. Протягом першої доби культивування амізон виявляв незначну цитотоксичну дію (рис. 8). На 3-ю добу культивування при концентрації амізону 1000 мкг/мл спостерігалася загибель 80% клітин. У присутності препарату амізон у концентрації 800 мкг/мл кількість життєздатних клітин становила 50% від загального числа клітин, а при концентрації 500 мкг/мл - 70%. Амізон у концентрації 200 мкг/мл виявляв незначну цитотоксичну дію, кількість нежиттєздатних клітин становила менше 10%. У нижчих концентраціях цитотоксичної дії препарату не спостерігалось. Цитотоксична доза (СD50), яка зменшувала кількість життєздатних клітин для амізону становила 800 мкг/мл.

Дію амізону на синтез ДНК клітин ФЛЕЛ з використанням методу мічення клітинної ДНК, досліджували в концентраціях 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл, 800 мкг/мл та 1000 мкг/мл (рис. 9). Підрахунок клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, показав, що у культурі, не обробленій амізоном, через добу 30% клітин перебували у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалась. Через три доби їх кількість становила 12%. У культурі, обробленій амізоном у концентраціях від 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, число клітин, що містили ³Н-ТД-мітку, через добу культивування незначно відрізнялось від контролю. При концентраціях препарату 100 мкг/мл та 800 мкг/мл число мічених клітин щодо контролю становило 60% і 30% відповідно. Через три доби число клітин, що синтезують ДНК, знизилось щодо контрольної популяції на 50% у присутності 100 мкг/мл амізону, при концентрації 800 мкг/мл на 100%. Таким чином, отримані дані показали, що на 3-ю добу 50% зниження числа клітин, що синтезують ДНК (CD50), відбувається при концентрації амізону 100 мкг/мл.

Рис. 8. Цитотоксичний вплив амізону на кількість життєздатних клітин ФЛЕЛ по осі ординат- % життєздатних клітин від контролю клітин, по осі абсцис – концентрація амізону, мкг/мл	Рис. 9. Цитотоксична дія амізону на пригнічення синтезу ДНК клітин ФЛЕЛ по осі ординат - % віл контролю клітин, що синтезують ДНК, по осі ординат- концентрація амізону, мкг/мл

Крім того, вивчали приріст клітин у контрольній і дослідній культурах. Для цього проводили підрахунок числа клітин на одиницю площі. Через три доби культивування відбувалося зменшення числа клітин на 50% щодо контрольної популяції при концентрації амізону 100 мкг/мл. Таким чином, концентрація препарату, що пригнічувала синтез ДНК на 50% та інгібувала приріст клітин на 50% для амізону складала 100 мкг/мл, виявилася значно нижче концентрації, що впливала на життєздатність клітин – 800 мкг/мл.

Дослідження анти-ЦМВ активності амізону у терапевтичній схемі досліджували у концентраціях 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,1 мкг/мл та при ІМ вірусу 0,001 БУО/кл та 0,0001 БУО/кл. Ні при одній із досліджуваних концентрацій амізону та інфекційній множинності вірусу препарат не виявляв інгібуючої активності відносно ЦМВ.

Дослідження впливу амізону на репродукції ЦМВ у профілактичній схемі було вивчено в присутності препарату у концентраціях 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, з ІМ вірусу 0,0001 БУО/кл й 0,001 БУО/кл (рис. 10). Присутність амізону у концентрації 5 мкг/мл при зараженні ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл приводила до пригнічення вірусоспецифічної ЦПД через 5 діб на 90%, з ІМ 0,001 БУО/кл - на 70%. Амізон у концентрації 1 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 70%, при ІМ 0,001 БУО/кл на 40%. Зменшення цитопатичної дії ЦМВ із ІМ 0,0001 БУО/кл було виявлено при концентрації 0,1 мкг/мл на 60%, із ІМ 0,001 БУО/кл - на 40%. Амізон у концентрації 0,05 мкг/мл інгібував здатність вірусу до утворення антигенвмісних включень при ІМ 0,0001 БУО/кл на 40% та при ІМ 0,001 БУО/кл на 30%.

Вплив амізону на розвиток ЦМВІ у клітинах ФЛЕЛ було вивчено також при використанні накопичувальної профілактичної схеми (рис. 11). Для цього препарат у концентраціях сполуки 5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл та 0,001 мкг/мл тричі вносили у культуру клітин - за 48 год., за 24 год. і за 1 год. до внесення вірусу (ІМ 0,001 БУО/кл і 0,0001 БУО/кл). Дослідження концентрацій сполуки показало, що ефективна доза (ЕD50) зменшується до 10% при вивченні усіх концентрацій ам