Реферат: Использование аффинной хроматографии

Реферат на тему:

Использование аффинной хроматографии

Активированные матрицы и спейсеры

Твердым основанием для аффинной матрицы чаще всего служат хорошо известные нам 4% или 6% сефароза, иногда химически скрепленная (CL-сефароза), а в некоторых специальных случаях (см. ниже) и целлюлоза.

Имеется множество способов химической активации как самих матриц, так и удаленных от матрицы концов спейсеров. Такая активация необходима для обеспечения простоты "посадки" на них лиганда (в условиях биохимической лаборатории).

Здесь нецелесообразно рассматривать все это множество способов, тем более, что большинство из них требует более серьезного знания органической химии, чем дает средняя школа. (Интересующимся и лучше подготовленным читателям я могу рекомендовать свою книгу "Хроматография белков и нуклеиновых кислот" ("Наука", 1985)).

Тем не менее, для иллюстрации подхода к проблеме опишу в общих чертах один простейший и ранее других предложенный вариант (впрочем, используемый до сих пор).

В нем активация полисахаридной матрицы, несущей на себе множество свободных ОН-групп, производится путем обработки ее бромцианом (BrCN). В результате получают (в сильно щелочной среде) прочно сидящие на нитях сефарозы химически активные группы имидокарбоната, согласно реакции. Эти электрофильные группы "охотно" образуют ковалентные связи с нуклеофильными группами лиганда.

Так например, лиганд, имеющий свободную аминогруппу, может связаться с актированной таким образом матрицей через остаток изомочевины.

Возможны еще два варианта протекания этой реакции (с выделением аммиака), но оба они приводят к тому же конечному результату: лиганд (или спейсер с аминогруппой на конце) химически прочно связывается с матрицей.

Безусловным недостатком описанного метода активации матрицы следует назвать ядовитость бромциана и токсичность некоторых побочных продуктов реакции (в том числе и НВг), содержащихся в промывных водах после активации сефарозы.

В качестве спейсеров обычно используют либо 1,6 диаминогексан,, либо 6-аминокапроновую кислоту. Таким образом на свободном конце спейсера оказывается аминогруппа или карбоксил. Присоединение к нему лиганда также требует специальной химической реакции.

Поэтому фирма "Pharmacia" выпускает готовые матрицы, в которых спейсер (6-аминокапроновая кислота) активирован этерификацией концевого карбоксила N-оксисукцинимидом.

Присоединение лиганда по аминогруппе происходит в мягких условиях, в течение одного часа, что очень важно для лабильных лигандов. N-оксисукцинимид отщепляется и на его место надежной пептидной связью присоединяется лиганд.

Лиганды

Великое множество лигандов, описанных в научной литературе, можно разбить на две главных категории. Это лиганды с индивидуальной специфичностью и лиганды с групповой специфичностью, В качестве индивидуальных лигандов могут выступать ферменты, а также субстраты или ингибиторы соответствующих ферментативных реакций (для очистки ферментов).

Использование в целях очистки аффинной пары фермент-субстрат предполагает такие условия хроматографического процесса, когда фермент не может осуществить каталитический акт преобразования субстрата, а только связывается с ним в фермент-субстратный комплекс. (Например в отсутствие необходимого второго субстрата, соответствующих ионов или при неблагоприятном значении рН).

С другой стороны, важный раздел биохимии, особенно в прикладном аспекте, составляет конструирование обменников с закрепленными ферментами, на этот раз ведущими катализ в условиях, когда его продукты легко отделяются от ферментов.

Эти продукты вытекают из колонки или остаются в супернатанте после проведения ферментативной реакции в объеме взвеси, из которой матрица с закрепленным на ней ферментом затем удаляется в осадок.

Естественно, что в этих случаях в окружении иммобилизованного фермента создаются условия не только связывания субстрата, но и катализа соответствующей реакции.

Очевидное преимущество ферментов, закрепленных на хроматографической матрице, заключается в простой возможности многократного использования этих ферментов, поскольку они автоматически освобождаются из смеси с продуктами реакции.

Так же, как ферменты, белки-рецепторы могут служить лигандами для связывания и очистки гормонов и других низкомолекулярных эффекторов. Транспортные белки плазмы крови и белки - переносчики клеточных мембран - для очистки своих низкомолекулярных партнеров.

Белки - регуляторы и участники процессов матричного синтеза, используемые в качестве лигандов, позволяют решать задачи по вычленению регуляторных и других особых участков нуклеиновых кислот. То же относится к системам выработки и транспорта энергии.

Разумеется, все участники названных здесь биоспецифических пар могут меняться ролями - те, что были иммобилизованы, могут стать объектом аффинной очистки. Весьма продуктивным оказалось и создание иммуносорбентов, обладающих сродством к определенным антигенам.

Лиганды с групповой специфичностью обладают сродством к целой группе веществ. К примеру, "кофермент А" участвует во многих ферментативных реакциях. Закрепленный на аффинной матрице, он может обеспечивать очистку любого из соответствующих ферментов. В тех случаях, когда в исходном препарате имеется только один из них, очистка будет не хуже, чем при использовании лигандов с индивидуальной специфичностью. Иногда групповая специфичность некоторых опытным путем отобранных лигандов не имеет даже четкого объяснения этой их способности.

Например, кислый аминополисахарид гепарин (М>10 000) известен в качестве антикоагулянта крови. Но кроме того он нашел применение в биохимии как конкурентный ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому, отражает определенное сходство полимера с РНК.

Поэтому гепарин может быть использован в качестве лиганда для ряда белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами: полимераз, растриктаз, обратной транскриптазы, факторов инициации белкового синтеза и других.

В качестве лигандов могут выступать и сами нуклеиновые кислоты. Есть способы химического закрепления их на активированных матрицах.

Но чаще ДНК и РНК, используя их нитевую структуру, закрепляют на матрицах нековалентно: либо заплавляют в 4%-ную агарозу в процессе ее затвердевания из расплавленного состояния, либо "запутывают" между нитями набухшей в воде целлюлозы - при ее высыхании.

На отобранных путем клонирования и закрепленных в аффинной матрице фрагментах ДНК, содержащих определенный ген, можно задерживать и очищать соответствующую этому гену иРНК.

Синтезированную в лабораторных условиях полиуридиловую кислоту (поли У) длиной в сотню мономеров уридина можно ковалентно фиксировать на BrCN-активированной сефарозе.

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--