Реферат: Использование аффинной хроматографии
На таком лиганде можно так же, как в предыдущем случае, через хвостовую поли А закрепить определенную иРНК. Затем с помощью обратной транскриптазы, для которой олиго дТ будет служить праймером, синтезировать по этой иРНК двунитевую к ДНК, которая в этом случае остается связанной с матрицей и сама может выступать в качестве лиганда.
На этом ограничим перечень возможных лигандов, далеко не исчерпав их список, и в заключение краткого очерка аффинной хроматографии рассмотрим три простых примера: два с индивидуальной специфичностью и один - с групповой.
Некоторые примеры использования аффинной хроматографии
Пример 1. Очистка фермента карбоксипептидазы А из мышцы крысы (Bodwell, Meyer, 1981).
На BrCN-активированную сефарозу 4В сажали белковый ингибитор карбоксипептидазы А, выделенный из картофеля. Фракцию гомогената мышцы, экстрагированную между 0,4М КС1 и 2М NaCI в нейтральном буфере, дополнительно очищали осаждением сульфатом аммония и сажали на аффинную колонку с ингибитором, уравновешенную тем же 2М NaCI в нейтральном буфере, затем промывали таким же раствором. Элюцию фермента вели тоже 2М NaCI, но в 0,01М Na2CO3 при рН 11,2.
Отрыв фермента от ингибитора происходил за счет сильного защелачивания элюента. Примесные белки выходили при промывке, а фермент элюировался острым пиком после смены буфера
Эффективность очистки на этом этапе можно оценить сопоставляя площади под двумя пиками, обозначенными пунктиром.
Иммунная система
Конечно же, мы не будем пытаться глубоко проникнуть в обширную область медицинской иммунологии. Коснемся только тех возможностей, которые использование иммунохимического подхода предоставляет для исследования биополимеров.
Однако для того, чтобы представить себе с чем мы будем иметь дело, необходимо, хотя бы поверхностно, познакомиться с механизмом выработки иммунитета, а также со специфическими клетками крови и молекулами его реализующими.
Широко распространенное понятие иммунитета до недавнего времени ограничивалось представлением о том, что речь идет о системе, обеспечивающей длительную неуязвимость человека для возбудителей болезней, которыми он однажды переболел хотя бы в самой легкой форме (прививка). Это тоже верно.
Но не будь у нас иммунной системы, то смертность от самых "пустяковых" на сегодняшний взгляд болезней была бы чудовищной. Человечество это по-настоящему поняло, когда столкнулось с вирусом СПИД, который атакует именно иммунную систему.
В наш организм из воздуха и пищи ежедневно проникают миллионы болезнетворных микробов и вирусов. Их всех встречает не знающее ни сна, ни отдыха "войско" иммунной защиты. Так что это за войско?
Люди, чуть знакомые с вопросом, говорят, что иммунная система вырабатывает некие "антитела", которые то ли убивают вторгшиеся микроорганизмы, то ли облепляют их, обезвреживают и вместе с собой выводят из организма.
Все это не совсем так. "Непрошенных пришельцев" уничтожают специальные крупные клетки - фагоциты. " Узнав" чужеродную клетку или вирус, они буквально "заглатывают" их. Наружная мембрана фагоцита образует углубление, наподобие мешочка, которое обволакивает "чужеземца". Потом горловина мешочка смыкается, оболочка фагоцита восстанавливается и "враг" оказывается в его цитоплазме. Здесь он подвергается атаке разнообразных литических ферментов, разрушающих сначала оболочку, а потом и сердцевину злокозненной жертвы.
В крови фагоциты называют гранулоцитами. Они входят в состав белых кровяных клеток - лейкоцитов" Фагоциты, оседающие в тканях тела, именуются макрофагами, В обоих случаях фагоцит должен в первую очередь "узнать" чужака. Вот здесь-то роль разведчиков и "наводчиков" выполняют особого рода белковые молекулы, именуемые антителами" Откуда они берутся и как узнают "противника"?
Вообще-то говоря, его в первую очередь "узнают" (с помощью антител) другие белые кровяные клетки - лимфоциты. Это - довольно мелкие клетки. До момента своей встречи с инфекцией лимфоциты не делятся и могут циркулировать в крови месяцы и годы. Большие скопления лимфоцитов находятся в лимфатических узлах и особенно в селезенке, через которую проходит вся кровь.
Встретившись с инфицирующим или просто посторонним агентом, оказавшимся в крови (их объединяют общим термином антигены) и "узнав" его, лимфоциты преображаются. Ускоряются процессы метаболизма, увеличиваются размеры, возобновляется синтез ДНК. Затем следует деление. В условиях острых инфекций один лимфоцит дает сотни тысяч клеток-потомков и все они сохраняют способность "узнавать" тот же самый антиген. Часть этих потомков так и останутся в крови, формируя иммунитет ("иммунологическую память").
Число "разведчиков", получивших приметы этого антигена, таким образом резко возрастает. В следующий раз, когда он попадет в кровь, то не успеет размножиться, как будет опознан. Но что же дальше? Как лимфоциты сообщают об опасности фагоцитам? И как, все-таки, они сами "узнают" антигены?
Только часть активированных первичной встречей с антигеном лимфоцитов размножается для создания иммунитета. Другая их часть претерпевает иную метаморфозу. Увеличивается объем цитоплазмы, ядро оттесняется в сторону, разрастается ретикулярная система. В рибосомах начинается интенсивный синтез особых белков - тех самых "наводчиков", которых мы выше назвали антителами.
Через аппарат Гольджи они выбрасываются наружу. Прошедшее эту метаморфозу лимфоциты, которых теперь именуют плазмацитами секретируют до двух тысяч антител в секунду. Часть их поступает прямо в кровь, а часть остается в лимфатических узлах, где оседают плазмациты. Все антитела, синтезируемые в потомках первого дозорного лимфоцита сохраняют способность узнавания того антигена, встреча с которым стимулировала всю цепь трансформаций.
Ну а первый лимфоцит, как он "узнал" антиген? Да при помощи тех же антител, которые в количестве примерно ста тысяч покрывали его поверхность. Получается замкнутый круг. Выходит дело, что узнающие данный антиген антитела существовали еще до его появления. Его ждали! Для того, чтобы "узнать" именно его и его потомков (если он способен размножаться), прилепиться к их поверхностям и тем самым пометить как цели для атаки фагоцитов.
Но откуда взялась первоначальная информация о структуре еще не появившегося в организме антигена? Большинство ученых считает, что все огромное множество вариантов такой информации, - заложены исходно, наследственным путем в таком же множестве изначальных лимфоцитов, быть может, как результат соответствующих "знакомств" в предыдущих поколениях животного или человека. (Некоторые ученые, напротив, полагают, что все иммунные ответы формируются в течение жизни человека под влиянием вторгающихся антигенов.
Они подчеркивают, что в первые месяцы жизни новорожденного, у него иммунная система еще не работает)
Попробуем оценить первую версию, оперируя некоторыми цифрами. Зададимся сперва вопросом: что же "узнают" антитела на поверхности антигена.
Ввиду возможного разнообразия природы и происхождения антигенов, скорее всего какую-то пространственную конфигурацию, которая может строиться из любого материала: из нескольких молекул аминокислот, липидов, Сахаров, нуклеотидов и даже из органических молекул не животного происхождения. Но эта конфигурация, ввиду избирательности связывания антитела с антигеном, должна быть непростой.
Вместе с тем, число заметно различающихся пространственных комбинаций органических молекул не безгранично, так как природа химических связей между молекулами накладывает свои ограничения. Предположим, что это число для всех возможных естественных (бактерии, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты и др.) и искусственных антигенов имеет величину порядка десятка миллионов (~107 ). Известно, что число лимфоцитов, содержащихся в организме человека ~1012 .
Это означает, что число "разведчиков", изначально располагающих "приметами" каждого возможного антигена ~105 . Это не так уж много по сравнению с общим числом лимфоцитов. Если "интервент" остается одиночкой, то вероятность встречи со "своим разведчиком" у него ничтожно мала. Но тогда от него и никакого ощутимого вреда быть не может.
Однако, как это всегда бывает, если в организм проникают одновременно многие тысячи одинаковых антигенов, то вероятность встречи соответственно возрастает. Особенно, если эти антигены суть болезнетворные микроорганизмы, которые начинают в нем быстро размножаться.
Тут уже ситуация меняется радикально, и вскоре "роковая встреча" становится неизбежной. Немедленно начинается массовая наработка антител нужной специфичности. Их размножение вступает в конкурентную борьбу с размножением "пришельцев".
Если антитела быстро выиграют эту гонку, то сумеют пометить собою всю "армию вторжения" и все ее солдаты будут уничтожены фагоцитами обоих типов прежде, чем появятся явные признаки заболевания. Такие явления происходят в нашем организме повседневно. Очевидно, что для фагоцитов безразлична природа антигена.