Реферат: Исследование ДНК волос для идентификации личности

ВВЕДЕНИЕ

Идентификация человека по волосам – одна из важнейших целей судебно-биологической экспертизы. Волосы практически всегда изымаются с места происшествия и часто бывают единственным вещественным доказательством. В настоящее время при исследовании этого объекта доминирует морфометрический метод исследования. При сравнительном исследовании волос, изъятых с места происшествия, и волос подозреваемого лица эксперт выявляет ряд морфометрических признаков (строение сердцевины и кутикулы, особенности пигментации и др.), что позволяет сделать лишь вероятный вывод о принадлежности волос конкретному лицу. Кроме морфометрического метода можно использовать серологический метод определения групповой принадлежности волос по системе АВ0, а при наличии луковицы волоса определять его половую принадлежность и фенотип фермента фосфоглюкомутазы. Однако эти методы не позволяют идентифицировать конкретного человека по волосам, оставленным на месте происшествия.

С этой целью необходимо использовать новый метод исследования волос - метод определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Известно, что метод определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов молекулы ДНК с применением цепной реакции полимеризации (амплификация) позволяет увеличивать количество фрагментов выделенной из объекта ДНК в сотни тысяч раз, что делает возможной идентификацию микроследов биологического происхождения, содержащих хотя бы одну ядерную клетку. При выделении ДНК из пятен крови не возникает тех проблем, что при выделении ДНК из волоса. Количество ядерных клеток (лимфоцитов) даже в небольшом пятне крови достаточно велико, волосы содержат существенно меньшее количество ДНК. Особенно мало ДНК в фолликулах выпавших волос (в 10 - 20 раз меньше, чем в живых) и в стержнях волос. В связи с этим специальные методы экстракции ДНК из волос являются важной проблемой и в значительной степени облегчают процесс идентификации волос.

Число зарубежных публикаций по этому вопросу не велико [1 - 3]. Описаны три варианта метода экстракции ДНК из волос: гидролиз ядер клеток луковицы волоса и амплификация без предварительной очистки, очистка гидролизата фенольным методом и с помощью ионообменной смолы Chelex.

Волосы, изъятые с места происшествия, могут либо иметь, либо не иметь целую волосяную луковицу, а также отдельные клетки (остатки) луковицы. Волосы могут быть вырванными, выпавшими или срезанными. Основное количество ДНК в волосе содержится в волосяной луковице, и исследование такого волоса значительно проще, чем исследование стержня волоса без луковичной части.

В настоящей работе описаны две методики выделения ДНК из волоса. Методики модифицированы и апробированы авторами в многочисленных исследованиях на экспериментальных и экспертных образцах волос человека, различающихся по размеру, цвету, наличию клеток луковицы, срокам хранения.

Одна методика проста, но может быть использована только при наличии луковицы вырванного волоса. Вторая методика позволяет выделять ДНК также прикорневой стержневой части волоса и усложнена специальным способом концентрирования и очистки выделенной ДНК перед амплификацией. Оценку количества и эффективности очистки выделенной ДНК определяли методом полимеразной цепной реакции. Процесс оптимизации этой реакции для исследования ДНК волоса не входил в задачи данной работы.

ОСНОВЫ СТРОЕНИЯ ВОЛОСА, МИКРОСКОПИРОВАНИЕ ОБЪЕКТА

Прежде чем приступить к выделению ДНК из исследуемого волоса, необходимо провести его микроскопирование и установить наличие или отсутствие луковицы волоса, а также по виду луковицы определить, живой или отмерший волос представлен на исследование. Кроме этого, в некоторых случаях микроскопирование позволяет установить наличие определенных загрязнений на волосе. Особенно принципиальным является наличие на волосе клеток крови или спермы (других выделений), что может исказить результат определения генотипа ДНК волоса. Загрязненные волосы особенно тщательно моют (см. ниже).

Известно, что волосы, являясь производными кожи, состоят из корня, расположенного в дерме, и стержня, выходящего на поверхность кожи через волосяную воронку. Корень волоса окружен эпителиальными оболочками - это фолликулы волоса. Расширенная часть фолликула называется луковицей волоса. Луковицы вырванного и выпавшего волос различаются по внешнему виду (рис. 1). Больше всего ядерных клеток содержится в луковице волоса, из которой можно выделить достаточное количество ядерной ДНК. Стержень волоса состоит из кутикулы (ороговевшие клетки), коркового слоя (кератиновые структуры) и сердцевины (фибриллярная система).

При исследовании ДНК волос, как показал анализ опубликованных данных, большое значение имеет наличие и количество пигмента волос - меланина. Показано, что меланин ингибирует реакцию амплификации и ее положительный результат зависит от соотношения в образце количества выделенной ДНК и количества меланина.

Меланин содержится в основном в сердцевине волоса и может быть в виде гранул или в диффузном состоянии. Меланины являются полимерами хиноидных соединений и образуются при ферментативном окислении тирозина. Волосы черного цвета содержат эумеланин, имеющий в структуре азот, для волос желтого и красного цвета характерен феомеланин. Меланин в эпителиальных клетках коркового слоя волос образует с белком волос - кератином мелано-кератиновые комплексы, которые имеют повышенную химическую устойчивость по сравнению с кератинами непигментированных волос. Эффект ингибирования реакции амплификации меланином имеет место, как правило, при исследовании ДНК стержня волоса и зависит от его цвета. Однако в описанной ниже методике действие меланина не учитывается, так как экстрагированная ДНК дополнительно очищается, в том числе и от основного количества меланина, с помощью специального устройства для концентрирования и очистки ДНК "Центрикон-100" (далее по тексту "Центрикон-100").

Микроскопирование волоса проводят без применения каких-либо химических реагентов, а именно без фиксации лаком, использования просветляющих жидкостей и т. п. Волос помещают на предметное стекло, добавляют 1 - 2 капли воды, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при увеличении 200^´ , 400^´ . Устанавливают наличие или отсутствие целой луковицы. При отсутствии целой луковицы определяют наличие отдельных эпителиальных клеток фолликула волоса, а при отсутствии эпителиальных клеток необходимо установить наличие прикорневой части стержня волоса. В стержне волоса основное содержание ядерных клеток локализовано в прикорневой части. На периферическом конце волоса ядерных клеток нет. Выделение ДНК из перифирического конца волоса рекомендуется использовать как отрицательный контроль для проверки отсутствия загрязнения биологическими примесями.

Кроме того, микроскопированием определяют наличие биологических загрязнений волоса (кровь, сперма, другие выделения), цвет волоса или его искусственную окраску.

ПОДГОТОВКА ВОЛОСА К ИССЛЕДОВАНИЮ, ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК

Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при покачивании, затем ополаскивают дистиллированной водой. Глицин, являясь слабым детергентом, повышает растворимость белков и способствует их отмыванию. Кроме того, отмыванию волос от биологических примесей способствует их предварительное выдерживание (1 - 2 ч) при низкой температуре (-20 ¸-70 °С), а также в растворе абсолютированного спирта.

Основным критерием того или иного метода экстракции ДНК из волос, как и из других источников, служит количественный выход хорошо очищенной ДНК. Известно, что концентрация ДНК, выделяемой из луковичной части вырванных живых волос, может достигать 200 нг на один волос. В то же время содержание ДНК в фолликулах выпавших волос с отмершей луковицей уменьшается до 10 - 20 нг. Содержание же ДНК в стержневой части волоса практически невозможно измерить известными в настоящее время методами, в том числе методом УФ-спектроскопии или флуориметрии.

В данной работе эффективность метода экстракции ДНК оценивали путем проведения реакции амплификации на мини-сателлиты с парой праймеров системы Д1 S80, дающей после проведения амплификации специфические ДНК-фрагменты размером от 400 до 800 пар оснований.

Амплификацию проводили в следующем режиме:

94 °C - 4 мин;

94 °C ü

60 °C ý 30 циклов по 1 мин;

72 °C þ

72 °C - 8 мин.

Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, нанося по 25 мкл реакционной смеси, визуализировали в УФ-свете и документировали фотографированием. В качестве контроля амплификации использовали фрагменты ДНК с известной молекулярной массой.

Положительный результат реакции амплификации указывает на высокую степень очистки исследуемой ДНК. Особенно это важно при выделении ДНК из стержня волоса, содержащего много меланина. Известно, что значительное количество соединений различной химической природы способны ингибировать реакцию амплификации и даже полностью блокировать синтез ДНК в процессе амплификации. Процесс ингибирования ПЦР носит ярко выраженный концентрационный характер, т. е. увеличение концентрации ингибитора приводит к уменьшению выхода целевого продукта амплификации. Меланин полностью ингибирует ПЦР в концентрации 15 нг в 100 мл реакционной смеси. В хорошо очищенном экстракте не должно быть ингибирующего действия меланина.

МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ СТЕРЖНЯ ВОЛОСА

Методика используется при исследовании всех вариантов волос, в том числе и волоса, не имеющего луковичной части. При отсутствии луковичной части волоса исследуют прикорневую часть стержня волоса длиной не менее 3 см и не более 10 см. Последовательность выполнения методики:

1. Волос микроскопируют и отмывают (как описано выше).

--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--