Реферат: Исследование ДНК волос для идентификации личности
3. В пробирку с волосом добавляют 500 мкл буфера I, 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 6 ч. В процессе выдерживания волос частично растворяется.
4. Пробирку помещают на вортекс (прибор для встряхивания) и встряхивают 30 с при средней скорости.
5. Затем к раствору в пробирке добавляют 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь), после чего волос полностью растворяется.
6. Пробирку вновь помещают на вортекс и встряхивают 30 с при средней скорости, затем центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. После центрифугирования продукты лизиса волоса переходят в супернатант.
7. Супернатант отбирают в чистую пробирку "Эппендорф", добавляют 600 мкл смеси фенол-хлороформ, закрывают крышкой, помещают на вортекс и перемешивают 15 с на средней скорости, а затем центрифугируют 3 - 5 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Наблюдают разделение на две фазы: верхняя водная фаза содержит выделяемую ДНК, нижняя – фенол-хлороформ.
8. Верхнюю водную фазу переносят в чистую пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл) и добавляют 500 мкл водонасыщенного н-бутанола с целью удаления остатка фенол-хлороформа, который может повредить мембрану "Центрикона-100". Помещают на вортекс, встряхивают 15 с на средней скорости и центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин при комнатной температуре. Водная фаза собирается на дне пробирки, верхний слой – удаляют.
9. "Центрикон-100" собирают по соответствующей инструкции и согласно рис. 3.
10. Нижнюю водную фазу, содержащую экстракт ДНК, фильтруют и концентрируют на "Центриконе-100", фильтрующем примеси с молекулярным весом более 100 000 дальтон. При данной фильтрации меланин волос и его производные, как более низкомолекулярные, проходят через мембрану "Центрикона-100".
11. Добавляют 1,5 мл ТЕ-буфера в верхний резервуар колонки "Центрикона-100". Сверху добавляют около 500 мкл экстракта ДНК. Пробирку закрывают парафильмом и, не касаясь раствора, прокалывают парафильм в нескольких местах тонкой чистой иглой. Центрифугируют на центрифуге с фиксированным углом ротора. Необходимо пересчитать скорость центрифугирования для используемой центрифуги в об/мин так, чтобы она составляла 1000g. Ниже приведена формула пересчета. Нельзя центрифугировать со скоростью более 1000g, во избежание повреждения мембраны "Центрикона-100". Время центрифугирования подбирают опытным путем так, чтобы ДНК сконцентрировалась в объеме 4 - 6 мкл, обычно не более 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования удаляют содержимое нижнего резервуара.
12. В верхний резервуар колонки "Центрикона-100", где концентрируется раствор ДНК в объеме 4 - 6 мкл, добавляют 2 мл ТЕ-буфера и повторяют фильтрацию 2 раза (закрыть парафильмом, проколоть его иглой, центрифугировать со скоростью 1000 g при комнатной температуре до объема 4 - 6 мкл ~20 мин, удалить содержимое нижнего резервуара, добавить 2 мл ТЕ-буфера и т. д.).
13. Профильтровав раствор ДНК 3 раза через мембрану "Центрикона-100", очистив его таким образом от примесей с молекулярным весом ниже 100 000 дальтон и сконцентрировав ДНК в заданном объеме (4 - 6 мкл), переносят раствор ДНК из верхнего резервуара в колпачок "Центрикона-100", который присоединяют к колонке верхнего резервуара и переворачивают. Центрифугируют 5 мин со скоростью 1000g при комнатной температуре. Все операции по фильтрации ДНК проводят с соблюдением максимально возможной чистоты и стерильности.
14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.
Для проведения ПЦР берут 4 - 6 мкл супернатанта при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.
Формула пересчета скорости вращения ротора центрифуги при использовании "Центрикона-100":
g = 118 × 10-7 × n2 × r ;
где g - центрифужное поле (g =1000);
r - радиус, см (расстояние от центра ротора до оси вращения колонки фильтра, измеряется эмпирически для используемой центрифуги);
n - скорость вращения ротора, об/мин (задается на центрифуге).
Приготовление растворов для выделения ДНК из стержня волоса
Ниже приводятся прописи шести растворов, которые готовят предварительно и затем используют при составлении смесей растворов, необходимых для данного метода. При приготовлении растворов используют деионизированную воду.
Раствор № 1. 1 М раствор трис-HCl, pH 7,5 (1 л):
растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести pH раствора до 7,5 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл), добавить воду до объема 1 л.
Раствор № 2. 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 (1 л):
растворить 186,1 г двузамещенной соли ЭДТА´2Н2 О в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 едким натром (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет 8,0), добавить воду до объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.
Раствор № 3. 5 М раствор NaCl (1 л):
растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды и довести объем раствора до 1 л. Разлить по 100 мл.
Раствор № 4. 20% раствор натрия додецилсульфата SDS (100 мл):
растворить 20 г SDS в 80 мл воды при 60 °С, довести объем раствора до 100 мл.