Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii
Получение высокоочищенных фракций ферментов – длительный, сложный и дорогой процесс, а применение комплексных препаратов не всегда даёт желаемый эффект и требует исследования условий гидролиза не только на чистых субстратах, но и при обработке сложных белковых систем. При этом интерес представляет как глубина протеолиза, так и качественная характеристика продуктов реакции, поскольку именно они определяют не только функциональные, биологические и технологические свойства продуктов, но и могут проявлять физиологические эффекты в составе пищи.
1.2 Ферменты, их физико-химические свойства.
Протеиназы, включающие ферменты микробного происхождения, составляют около половины производства препаратов на мировом рынке. Их эффективность и мощность намного превосходят синтетические катализаторы. Они высокоспецифичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определённые химические реакции без образования побочных продуктов; ферменты функционируют в разбавленных водных растворах при физиологических значениях рН и температуры.
Ферменты – функциональные единицы клеточного метаболизма. Действуя в строго определённой последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы питательных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия, и из простых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в состав клетки.
Ферментативный катализ происходит на расстоянии длины химической связи, поэтому акт катализа совершается на определённом участке поверхности макромолекулы, называемом активным центром. Современный уровень экспериментальных исследований позволил доказать, что он представляет собой набор небольшого числа функциональных групп, расположенных близко друг от друга и имеет вид впадин, выемок на поверхности молекулы фермента. Функциональные группы активного центра могут принадлежать звеньям полипептидной цепи, весьма удалённым друг от друга. Сближение их связано с формированием третичной структуры молекулы фермента.
Вполне логично, что активный центр не имеет автономного существования. Нельзя провести какую-либо грань между активным центром фермента и остальной частью белковой молекулы. Именно это и является одной из причин высокой чувствительности и лабильности активного центра к различным воздействиям.
К наиболее важным характеристикам ферментных препаратов, которые определяют возможность их применения на практике, относят рН, температурный оптимум, субстратную специфичность. Кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.
В 1964 году была получена в высокоочищенном состоянии нейтральная протеиназа Bacillus subtilis. Фермент имеет довольно широкий оптимум рН 6,5 – 8,0. В щелочной области рН её активность снижается, достигая при рН 9,0 – 30% максимальной величины. Таким образом, ферменты активны только в определённом интервале рН. В большинстве случаев для каждого фермента имеется определённый оптимум рН. Это объясняется несколькими причинами:
- истинное, обратимое влияние рН на скорость реакции (когда фермент насыщен субстратом);
- влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства);
- влияние рН на стабильность фермента, который может необратимо инактивироваться при рН по одну или обе стороны от оптимума.
Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом. Например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом уменьшения сродства фермента к субстрату, а по другую – результатом инактивации фермента.
Итак, для всех известных ферментов зависимость скорости реакции от рН графически выражается в виде «колоколообразной» функции. Такие кривые строятся на основе данных, полученных при измерении скоростей реакции, протекающей в буферных растворах с разными значениями рН.
Форма кривых, описывающих зависимость скорости ферментативной реакции от рН, отражает способность важных для данного фермента протон - донорных связей или протон – акцепторных групп в его каталитическом центре переходить при определённых значениях рН в состояние требуемой степени ионизации.
Методы анализа температурных зависимостей кинетических и равновесных параметров ферментативных реакций основываются на классических принципах термодинамики и кинетики. Ферментативные реакции характеризуются также наличием «колоколообразной» зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком температурном интервале, что приводит к температурному оптимуму реакции. Эта способность влияния температуры на кинетику ферментативных реакций объясняется наложением двух эффектов (возрастание скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах).
Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, даёт основание ожидать, что анализ этого явления должен представлять большие трудности. В действительности, однако, влияние температуры легко установить экспериментально. Влияние этого фактора на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определённого периода времени, а за тем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остаётся стабильным.
Хорошо изученными являются протеиназа из Bacillus amyloliguefarias [31] и протеиназа из Bacillus thermoproteolyticus (термолизин). Они довольно близки по своим свойствам. Однако термостабильность их значительно различается, так термолизин теряет 50% максимальной активности при температуре 84о С, за 15 минут при рН 7,2 , в то время как протеиназа Bacillus amyloliguefacieus теряет за то же время 50% активности при температуре 59о С.
Ферментативная реакция в целом состоит, по крайней мере, из трёх последовательных стадий: образование фермент-субстратного комплекса, превращение этого комплекса в комплекс фермент-продукт и диссоциация промежуточного продукта. Влияние температуры на реакцию в целом является результатом её влияния на каждую из этих стадий.
Известно много ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с оптимальными параметрами рН и температуры. Таким образом, внешние факторы позволяют с достаточным эффектом регулировать интересующие процессы, особенно при технологической обработке биологических объектов, например мяса и мясных продуктов.
Специфичность ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. По-видимому, только тогда, когда совпадение это достаточно полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно, начаться процесс ферментативного катализа. Детальное изучение специфичности ферментов показало, что пределы её у разных ферментов различны. Одни ферменты обладают абсолютной специфичностью, т.е. каталитически ускоряют одну – единственную реакцию. Примером такого фермента может служить уреаза. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определённого типа независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой специфичностью. Наконец, некоторые ферменты отличаются стереохимической специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров. Примером могут служить ферменты, расщепляющие a- и b-метилглюкозиды.
Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого. Современная классификация основана на этом признаке. Ферменты делят на группы в зависимости от типа катализируемой реакции и на подгруппы, более точно характеризующие эту реакцию.
Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более мало изученные, подразделяются на группы в зависимости от оптимального значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы:
1. Щелочные протеиназы, стабильные и активно действующие в области рН 5 – 10. Максимальная их активность обнаруживается при рН 9,5 – 10,5. Установлено, что это главным образом сериновые протеиназы (для акта катализа важную роль играют функциональные группы серина); они активно ингибируются диизопропилфторфосфатом (ДФФ).
2.Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для протеолиза около 7,0. В эту группу объединяют большинство металлоферментов, чувствительных к таким аддентам, как ЭДТА и о-фенантролин. Они не ингибируются ДФФ и тиоловыми реагентами, устойчивы при рН 6 – 9.
3.Кислые протеиназы, активные при рН 2 – 5, не чувствительные к сульфгидрильным реагентам, металлохелатным агентам, тяжёлым металлам и к ДФФ. Для акта катализа этой группы ферментов важны остатки карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот.
Вместе с тем отметим, что зависимость активность – рН носит подчинительный характер и связана со структурой активного центра,
определяющего механизм действия.
1.3 . Выделение и очистка препаратов протеиназы.
Современный уровень науки и техники позволяет получить не только комплексные, но и гомогенные, кристаллические ферменты. Их, как правило, выделяют непосредственно из биомассы гриба или культуральной жидкости, а так же из экстрактов поверхностных культур.
В качестве осадителей при получении комплекса препаратов протеиназ применяют сульфат аммония [14, 17], этанол [17], ацетон, изопропанол [24].
Отмечается, что в зависимости от применяемого осадителя выход фермента бывает различным. Так при использовании различных органических растворителей в концентрации 80% , выход протеолитических ферментов составил: 56% - для этанола, 78% - изопропанола, 65% - ацетона.