Реферат: Механизмы устойчивости опухолей к цисплатину
Одним з основних механізмів клітинної резистентності до цисплатина розглядають особливості будови цитоплазматичної мембрани та прямого та зворотнього транспорту крізь неї.
Однією з особливостей пухлинних клітин, резистентних до дії цисплатина, є зменшена у порівнянні з чутливими клітинами акумуляція препарату [31,32].
Дана модель пояснює, чому так багато клітинних ліній резистентних до дії цисплатина відрізняються зменшеним накопиченням цисплатина. Мутації, що призводять до змін структури каналів чи гіперполяризації клітинної мембрани, можуть спричинити виникнення резистентного клона клітин.
Нещодавно до клітин мишиної лімфоми R1.1, резистентних до дії цисплатина були одержані антитіла, які реагували з глікопротеідом з молекулярною масою 200кД, гіперекспресованим на поверхні цих клітин. Кількість білка на клітинній поверхні знаходилась у зворотній залежності від акумулювання цисплатина у клітинах та корелювала з рівнем їх чутливості до цисплатина. Було запропоновано, що даний білок може бути аналогом Р-глікопротеіда (Pgp) і є непрацездатним каналом, що гіперекспресований на клітинній поверхні для компенсації дефектної функції [33].
В резистентних до цисплатина клітинах з підвищеним вмістом глутатіона часто спостерігається гіперекспресія ГS-Х-помпи. В цитоплазматичних везикулах таких клітин знаходиться більше кон`югатів ГS-Pt, ніж в чутливих клітинах [34]. Така внутрішньоклітинна компартменталізація ліків та продуктів їх метаболизму також вважається одним з механізмів лікарської резистентності. В багатьох випадках резистентні пухлинні клітини відрізняються розвинутою везикулярною сіткою, що дозволяє їм просторово нейтралізувати токсини та виводити їх шляхом екзоцитозу.
В експериментах з використанням бутионінсульфоксиміна (BSO), інгібітора синтезу глутатіона, було показано, що при витощенні внутрішньоклітинного глутатіона активність ГS-Х-помпи лише трохи зменшується [35]. Таким чином, ефективність транспорту ГS-Pt-кон`югатів визначається не тільки концентрацією останніх, а й експресією переносника.
Останнім часом з`явилися роботи, що засвідчують, що білок, асоційований з загальною лікарською резистентністю (MRP але не Pgp) може функціонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гіпотеза підтверджується такими фактами: 1) клітини, що гіперекспресують MRP секретують у культуральне середовище більше глутатіона; 2) витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO запобігає виведенню ліків з клітин за допомогою MRP; 3) гіперекспресія MRP відповідає підсиленому АТФ-залежному транспорту кон`югатів ГS-Х; 4) антитіла до MRP реагують з білком з молекулярною масою 190 кД, який може зв`язуватись з ГS-кон`югатами та лейкотрієном С4 .
Таким чином, видалення з клітин комплексів глутатіон-S-платина переносниками з активністю ГS-Х-помпи є важливим механізмом резистентності, завдяки якому внутрішньоклітинна концентрація препарату підтримується на низькому рівні, що сприяє зменшенню його пошкоджуючого ефекту.
4.2.Внутрішньоклітинні тіолові детоксикуючі системи
4.2.1. Система глутатіона
Глутатіон та ферменти його метаболізму є важливими елементами меxанізму резистентності клітин до алкілуючих агентів, в тому числі сполук платини.
Більшість клітинних ліній, резистентних до дії цисплатина відрізняються підвищеним вмістом внутрішньоклітинного глутатіона та/чи гіпреактивністю фермента, що ініціює синтез глутатіона g-глутамілцистеінсинтетази (g-ГЦС) [38-40]. Однак описані приклади стійких до дії цисплатина клітинних ліній з нормальним [41,42] та зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом глутатіона.
Сучасні стереоскопічні та спректроскопічні методи дозволили визначити, що глутатіон та цисплатин реагують безпосередньо у безклітинній системі в молярному співвідношенні 2/1, утворюючи хелатний комплекс диглутатіонплатини. Після 12 годин інкубації клітин в середовищі з цисплатином концентрація ГS-Pt-кон`югатів стає максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини знаходиться у зв`язаному стані [10].
Заслуговують на увагу дані, отримані в експериментах з використанням інгібітора синтезу глутатіона бутіонінсульфоксиміна (BSO). Обробка BSO клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та MKN-45 , раку яєчника КК та МН, аденокарциноми ротової порожнини КВ призводить до сенсибілізації клітин до дії цисплатина [44,45]. Причому витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO не впливало на акумулювання цисплатина в клітинах а також формування кон`югатів GSH-Pt [46].
При вивчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона та їх ролі в механізмах резистентності велике значення мають експерименти з використанням культур клітин, трансфекованих генами відповідних ензимів. Наприклад, клітини раку легенів людини, трансфековані геном фермента g-ГЦС, мають у 2 рази більше глутатіона, в 1,6 рази підвищену активність ГS-Х-помпи та в 1,5 рази меньшу акумуляцію цисплатина, в 6,7 рази більшу резистентність до цисплатина у порівнянні з батьківською клітинною лінією. Витощення внутрішньоклітинного глутатіона в трансфектах за допомогою BSO не впливало на резистентність до цисплатина. У таких випадках зберіглась висока активність ГS-X-помпи і тому внутрішньоклітинна концентрація платини не змінилася. Таким чином, в даній клітинній системі резистентність обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-конюгатів за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своєї активності навіть при витощенні субстрата (глутатіона) [47].
В той же час не винайдено ніякого зв`язку між рівнем експресії глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази та ступенем стійкості клітин до дії цисплатина [48,49].
4.2.2.Металотеонеіни
Особлива роль у формуванні резистентності відводиться металотеонеінам.
Оскільки у вільному стані ці сполуки нуклеофільні, металотеонеіни зв`язуються з електрофільними протипухлинними препаратами типу цисплатина, а також мелфаланом та деякими антибіотиками: адріаміцином, блеоміцином та доксорубіцином.
Клітини, що гіперексперсують металотеонеіни, часто резистентні до дії цисплатина [50,51]. Однак металотеонеін не є обов`язковим компонентом резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються резистентні до цисплатина клітинні лінії, в яких металотеонеін не виявляється [43].
При обробці цисплатином резистентних до препарата клітин з підвищеним вмістом металотеонеіна 70% внутрішньоклітинної платини знаходять у зв`язаному з білком стані.
Досліди по трансфекції гена металотеонеіна ІІа показали, що клітини-трансфекти набувають резистентності до цисплатина, хлорамбуцила та мелфалана [52].
Добре виражена експресія металотеонеіна в пухлинах може мати прогностичне значення. Наприклад, при лікування хворих на рак стравоходу за допомогою цисплатина 5-річна життєздатність пацієнтів з металотеонеін-від`ємними пухлинами становить 56%, а пацієнтів з металотеонеін-позитивними пухлинами – 26% [53].
З наведених вище даних можна заключити, що у випадках підвищеної експресії металотеонеін є важливою складовою резистентності до цисплатина.
4.3.Репарація пошкоджень ДНК.
Резистентність клітин до дії цисплатина може залежати від стану системи репарації пошкоджень ДНК.
Один з механізмів резистентності клітин до цисплатину – прискорена репарація цисплатин-ДНК-адуктів [54]. Чутливі до дії цисплатина клітинні лінії відрізняються зниженою здатністю ліквідувати основні адукти ДНК та цисплатина (GG-Pt та GA-Pt), а також послабленою активністю ДНК-полімераз [55,56]. Обробка резистентних до цисплатина клітин афідикоіном – інгібітором ДНК-полімераз a та b повертає чутливість до цисплатина, що стверджує роль репарації адуктів цисплатин-ДНК у формуванні резистентності [57].
На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платинування ДНК у мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo G) може брати участь у репаративних процесах цих органел [58].
Нещодавно з культуральної рідини пухлинних клітин та біопсійного матеріалу пухлин людини були виділені білки HMG (high-mobility group) та їм подібні, які зв`язуються з ДНК, що пошкоджена цисплатином, але не трансплатином чи ультрафіолетовим випроміненням [59,60]. Ці білки – висококонсервативні, локалізуються у цитоплазмі та ядрі клітини. Їх біологічна роль ще точно не встановлена. Інтенсивність зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними білками прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клітин зв`язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки взаємодіють з платинованою ДНК, закривають пошкоджені сайти від ферментів ексцизійної репарації. Припускають, що зв`язування HMG-подібних білків з пошкодженою ДНК може викликати зупинку реплікації чи транскрипції, а також впливати на роботу систем контролю клітинного циклу при руйнуванні ДНК.
Відомо, що такі дефекти системи репарації невідповідностей (mismatch repair), як недостатня експресія білків hMSH2 чи hMLH-1, призводять до виникнення резистентності до цисплатина [61,62]. MSH2-білок сам по собі чи разом з білком GTBP/p160 розпізнає невеликі зміни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти платинування ДНК, і зв`язується з ними.
Априорі можна було б припустити, що відсутність якої-небудь частини системи репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до дії цисплатина, що відбувається у клітинах, дефектних за системою ексцизійної репарації. Але у випадку порушення функції системи mismatch repair клітина набуває резистентності до цисплатина. Цей феномен можна розглядати з двох позицій. По-перше, порушення системи mismatch repair може бути наслідком індукованого цисплатином випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює стійкість до дії цисплатина. По-друге, саме дефект у роботі цієї системи репарації може покласти початок резистентності [63,64].
Комплекс білків репарації “розпізнає” адукти у ланцюгу-шаблоні ДНК та намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так, поки існує адукт у ланцюгу-шаблоні, а підбір нових основ не ліквідує невідповідність, що існує, генерується сигнал, який запускає програму апоптозу. Якщо система mismatch repair не працює, такий сигнал не генерується, клітини стають толерантними до адуктів цисплатин-ДНК та набувають резистентного фенотипу.