Реферат: Механизмы устойчивости опухолей к цисплатину

Показано, що цисплатин індукує експресію важливого для ексцизійної репарації гена ERCC-1. Але до активації гена ERCC-1 відбувається активації генів c-fos та c-jun, а також фосфорилювання білка c-Jun [67].

Нещодавно був відкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацією пошкодженої ДНК. Показано, що гіперекспресія цього гена в клітинах рака яєчника та молочної залози асоційована з резистентністю до дії цисплатина [68].

Топоізомерази І та ІІ, що релаксують спіралі ДНК, є важливими ферментами реплікації, транскрипції та рекомбінації. Вони відіграють суттєву роль у процесах усунення адуктів ДНК-цисплатин. У багатьох резистентних до дії цисплатина клітинах спостерігається підвищена активність топоізомерази ІІ [69]. Інгібітори топоізомераз І та ІІ: етопозид, камтотецин, СРТ-11, SN-38, новобіоцин – викликають сенсибілізацію резистентних клітин до дії цисплатина [70-72].

Ще одним механізмом резистентності до цисплатина на рівні ДНК може бути підвищена концентрація в клітині вільних нуклеотидів (наприклад, АТФ, АДФ), які конкурують з ДНК за зв`язування з цисплатином [73]. Таким чином, вільні нуклеотиди, концентрація яких у цитоплазмі відрізняється в різних клітинах, можуть значно впливати на чутливість пухлин до цисплатина.

Важливо також розглянути утворення зшивок ДНК-білок під дією цисплатина. Хоча кількість цих адуктів набагато менше, ніж у разі між- та внутри- ланцюгових зшивок, але відмічено, що вони також відповідальні за цитотоксичний ефект цисплатина. Наприклад, було показано, що одна резистентна до дії цисплатина клітинна лінія раку яєчника утримувала у 6 разів менше цитокератина 18, ніж чутлива лінія. Трансфекція кДНК цитокератина 18 в клітини резистентної лінії давала клони з підвищеним рівнем цього білка та у більшості випадків з чутливим фенотипом. При цьому було встановлено, що після обробки цисплатином, з ДНК у клітинах зв`язуються негістонові білки. Пізніше ці білки було ідентифіковано як цитокератини [74]. Можливо, що формування зшивок цитокератин-ДНК, асоціюється з цитотоксичністю цисплатина. Тоді зменшення продукції цитокератина 18 у резистентних клітинах веде до зменшення кількості зшивок білок-ДНК та, як наслідок, зниження чутливості до цисплатина.

Виходячи з вищенаведеного, можна заключити, що резистентність до дії цисплатина на рівні ДНК обумовлена підвищеною активністю систем репарації клітини чи її толерантністю до існуючих ДНК-Pt-адуктів.

4.4.Зміни генома, що асоційовані з резистентністю до цисплатина.

Оскільки клітинна резистентність є стійко спадковою ознакою в ряду поколінь, можна зробити висновок, що стійкість до дії цисплатина визначається генетичними особливостями клітини.

Встановлено, що основна роль в цьому феномені належить 11-й та 16-й хромосомам у людини [75]. На клітинних гібридах з різним хромосомним складом було показано, що обовязковою умовою резистентного фенотипа є наявність 16-ї хромосоми з резистентних клітин та 11-ї хромосоми з чутливих клітин. При цьому основну роль грає 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхідна для її нормального функціонування. Ці хромосоми залучені у різні боки резистентності. На 16-тій хромосомі присутні гени MRP (multidrug resistance associated protein), LRP (lung resistance protein), гени додаткового білка ексцизійної репарації-4, металотеонеіна. На 11-їй хромосомі розташовані гени, що кодують глутатіон трансферазу p (ГSТ-p), а також протеін, що розпізнає специфічні послідовності пошкодженої ДНК.

Чутливість пухлинних клітин до дії цисплатина може залежати від функціональної активності генів р 53 та генів родини bcl.

На сьогодні все ще залишається відкритим питання про зв`язок лікарської резистентності з р 53 -статусом клітин. Невизначеність тут існує тому, що роль білка Р 53 у хемочутливості клітин до лікарської терапії розглядають з двох протилежних точок зору: 1) експресія білка Р 53 дикого типу (wt p 53 ) збільшує чутливість до хіміотерапії шляхом прискорення входження клітин в апоптоз; 2) білок wt P 53 зменшує хемочутливість, оскільки після пошкодження ДНК обумовлює зупинку росту для репарації ДНК [76].

Відомо, що після дії цисплатина у чутливих клітинах збільшується рівень експресії гена р 53 та відповідно – білка Р 53. Р 53 індукує експресію білка р 21/WAF1/CIP1-інгібітора циклін залежних кіназ, що грає важливу роль у зупинці клітинного циклу у G₁ -фазі після генотоксичного стресу [77,78]. Під час цієї зупинки клітиною приймається “рішення”: репарувати ДНК чи входити в апоптоз, в залежності від глибини пошкодження. На сьогодні ще невідомі усі біохімічні подробиці того, як активація р 53 ініціює апоптоз.

Більшість робіт по вивченню функціональної активності Р 53 у резистентних до дії цисплатина клітинах засвідчують, що мутації гена р 53 призводять до розвитку резистентності до хіміотерапії [79-82]. Показано, що в резистентних клітинах часто порушена внутрішньоклітинна локалізація білка Р 53 [83] а також не відбувається індукція експресії Р 53 та р 21 цисплатином [84,85]. Досліди по трансфекції гена р 53 також довели, що перенос у дефектні за функцією Р 53 чи null-клітини wt p53 -гена обумовлює збільшення чутливості до лікарських препаратів, а трансфекція мутантного гена mut p 53 спричиняє розвиток резистентності [86].

Досліджено, що в клітині після дії цисплатина разом з р 53 індукується експресія гена mdm 2 . Продукт даного гена відрізняється властивістю утворювати комплекси з білком Р 53 , таким чином дезактивуючи частину внутрішньоклітинного Р 53. В резистентних до цисплатина клітинах іноді спостерігається гіперекспресія гена mdm 2 [87] а використання антисмислових (проти mdm 2 ) нуклеотидів у такій системі призводить до збільшення чутливості до лікарської терапії [88].

Таким чином, функція Р 53 може бути інактивована двома шляхами: мутаціями безпосередньо гена р 53 а також підвищеним комплексоутворенням Р 53 з MDM 2.

Але дані деяких досліджень заперечують, що мутації р 53 обов`язково спричиняють розвиток лікарської резистентності. Feudis з співавторами показали, наприклад, на 9 клітинних лініях раку яєчника з різним р 53 - статусом, що в цих клітинних лініях після обробки цисплатином рівень експерсії р 21 підвищується однаковo і немає різниці у чутливості до апоптозу, індукованого дією препарата [89,90].

Однак відомо, що більш половини злоякісних новоутворень людини відрізняються мутаціями р 53, i ця ознака є важливим показником чутливості пухлин до хіміотерапії [91]. У клінічних дослідженнях показано, що рівень експресії р 53 у зразках біопсійного матеріала при раку шлунка та яєчників може бути важливим прогностичним показником захворювання [92]. Досліджено, що Р 53-позитивний фенотип пухлин асоціюється з поганим прогнозом [93,94]. Це пояснюється тим, що мутантна форма білка має подовшений час напівжиття і тому легше виявляється імуногістохімічно.

Білки родини Bcl (Bcl-2, Bcl-X_l , Bcl-X_s , Bax та інші) грають важливу роль у регуляції процесу апоптоза. Деякі з них (Bcl-X_l , Bcl-2) гальмують розвиток апоптоза, тоді як інші (Bcl-Xs, Bax, Bak) – навпаки є промоторами цього процесу. Відомо, що білки даної родини здатні гетеродимеризуватись, утворюючи умовний “реостат”, який регулює функціональну активність білків [95]. Досліджено, що білки Bcl-2 та Bcl-X_l гіперекспресовані при багатьох неопластичних захворюваннях людини. Причому така гіпрекспресія асоційована з резистентністю пухлинних клітин in vitro до протипухлинних препаратів [96]. Така стійкість клітин пов`язана з порушенням механізмів індукції апоптозу у відповідь на лікарську терапію. У дослідах з використанням клітин траксфекованих генами bcl-2 чи bcl-x_l було показано, що трансфекти набувають резистентний фенотип до цілого ряду лікарськиї препаратів включаючи цисплатин [97,98]. У таких модельних клітинах була значно зменшена деградація ДНК після обробки цисплатином. Якщо порівнювати внесок продуктів генів bcl-2 та bcl-xl у антиапоптозному ефекті, то показано, що білок Bcl-X_l має більший вплив [99].

Після обробки цисплатином у чутливих клітинах, що входять в апоптоз, не змінюється рівень експресії білків Bcl-2, Bcl-X_l та Bax (24kDa), але підвищується рівень білків Bak та Bax (21 kDa), тобто білків-агоністів апоптозау [100-102]. Відомо, що в деяких резистентних до цисплатина клітинних лініях спостерігається знижений рівень експресії Bax [103], а трансфекція гена bax спричиняє підвищення чутливості до хіміотерапії [104]. А от клітини з підвищеною експресією Bak відрізняються більшою чутливістю до дії цисплатина [105].

Відомо, що білок Bcl-2 часто гіперекспресований у пухлинах людини. Причиною такої гіперекспресії вважають часті ділеції великих нетрансльованих послідовностей з 3 та 5 – кінців гену bcl-2 (78-А). Дещо суперечливі дані імуногістохімічних досліджень експресії білків родини Bcl у зразках біопсійного матеріалу та прогнозування чутливості до лікарської терапії у порівнянні з дослідженнями in vivo . Наприклад, одні дослідники повідомляють, що Вcl-2-позитивні неоплазії мають слабку відповідь на хіміотерапію та поганий прогноз [106,107], інші – навпаки, спостерігають, що експресія Вcl-2 у пухлинах асоціюється з покращеним виживанням [108]. Експресія Вax окремо не має ніякого прогностичного значення [109].

Роботи, зроблені з використанням резистентних до дії цисплатина лініях клітин показали важливість онкогена fos в резистентності до цього препарату. В резистентних лініях клітин спостерігали підвищений рівень експресії гена fos. Були визначені дві важливі функції Fos-білка: транскрипційна активація синтеза ДНК та участь у клітнинній проліферації. Fos-білок контролює клітинну відповідь на пошкодження ДНК цисплатином через активацію генів топоізомерази І, полімерази b та металотеонеіна [2].

Повідомляється про те, що гіперекспресія супресорного гена nm 23 супроводжується, як правило, збільшенням чутливості до дії цисплатина. Дані результати отримано з досліджень in vitro на клітинних лініях карциноми молочної залози людини MDA-MB-435, лінії карциноми яєчника OKAR-3 та лінії меланоми К-1735-ТК, а також при дослідженні клінічного матеріалу пухлин молочної залози. У всіх досліджуваних системах гіперекспресія nm 23 призвела до формування у клітинах великої кількості міжланцюгових зшивок ДНК та збільшення чутливості до цисплатина [110].

Цікавими є дані по переносу резисткнтного до цисплатина фенотипу при трансфекції генів v-src. Непухлинні епітеліальні клітини людини HAG-1 після трансфекції гену v-src набували неопластичного фенотипу та резистентності до цисплатина. У трансформованих клітинах спостерігали значне зменьшення формування міжланцюгових зшивок ДНК з їх послідовним швидким видаленням. Після обробки даних клітин інгібіторами src-кіназ знижувався рівень резистентності до цисплатина. Результати цієї роботи вказують на можливість участі продукту гена v-src в індукції резитентності до цисплатина шляхом модуляції деяких шляхів репарації ДНК [111].

Ампліфікація гена сорцина (кальцій-звязуючого білка з молекулярною масою 19-22кД) в деяких модельних системах асоціювалася з резистентним фенотипом [112]. Важко зараз сказати, чи є резистентність пов`язаною саме з сорцином чи разом з геном сорцина у клітинах ампліфіковані і інші, більш важливі для розвитку резистентності гени.

Таким чином резистентність до цисплатина має комплексний характер і пов`язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматичної мемрани, внутрішньоклітинних систем детоксикації, систем репарації та порушення функціональної активності генів p 53, bcl-2, fos, mdm 2, nm23 та інших.

Список літератури

1. Чехун ВФ. Роль плазматичних мембран нормальних і пухлинних клітин в механізмі реалізації цитотоксичних ефектів координаційних сполук платини [Автореф дис ... докт мед наук]. Киев: ИЭПОР, 1994. 40 сс.

2. Scanlon KJ, Kashani-Sabet M, Tone T, Funato T. Cisplatin resistance in human cancers. Pharmacol Ther 1991; 52:385-406.

3. Gately DP, S.B.Howell SB. Cellular accumulation of the anticancer agent cisplatin. Br J Cancer 1993; 67:1171-6.