Реферат: Методы разделения иммуноглобулинов

Каждая индивидуальная клетка вырабатывает антитела только одной специфичности по правилу "одна клетка " одно антитело" (Петров , 1987). Это означает, что в клетке активно функциони­руют только один вариант гена V_H , один - гена С_H и по одному соответствующему гену одной из легких цепей. Все остальные структурные гены выключены. В каждой отдельно взятой антитело-образующей клетке из всего множества структурных генов иммуноглобулинов функционирует их минимальное количество, необхо­димое для синтеза антител одной специфичности и одного типа. Таким образом, в основе многообразия специфичности антител лежит функционирование в лимфоидной системе большого количест­ва клеток и их потомков -клонов клеток- продуцентов одного ви­да антител. Следовательно, количество специфичностей антител соответствует количеству клонов клеток- антителопродуцентов, различающихся генами, функционирующими в них.

Установлено, что V-ген данной специфичности способен поо^ чередно ассоциировать с генами, кодирующими С_g , С_m , С_a , т.е.антителообразующие клетки способны переключать синтез иммуноглобулина М на IgG и на IgA, не изменяя антительной спе­цифичности. Таким образом, антитела против альбумина быка мо­гут находиться как во фракции IgG, так и во фракциях: иммуноглобулинов М и А.

КЛАССЫ И ПОДКЛАССЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Как уже указывалось, иммуноглобулины имеют общие характерные свойства. Однако их отдельные классы и подклассы отличаются первичной структурой, антигенными и физико-химическими свойствами и биологической активностью.

а) Иммуноглобулины класса G. IgG представляет собой наиболее изученное антитело, в большом количестве присутствующее в сыворотках крови всех млекопитающих и птиц. IgG составляет около 70-80% от общего содержания иммуноглобулинов. Молеку­лярная масса - 150 000 - 160 000 (Незлин, 1972).

Молекула иммуноглобулина G- построена из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями. Характерны тяжелые полипептидные цепи. IgG человека существует в виде 4 подклассов (G₁ , G₂ , G₃ , G₄ , отличающихся строением постоянных участков тяжелых цепей, а следовательно, и антигенными и биологическими свойствами (Незлин, 1972, Герман и др., 1977, Басова, Стефани, 1977). Подклассы различаются 2 количеством дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи: в молекулах G₁ и G₄ их по 2, в G₂ , - 4, а в G₃ , -5. IgG₁ составляет 70% от общего содержания IgG, а IgG₂ , IgG₃ , IgG₁ 18, 8 и 3%, соответственно.

У всех изученных видов животных найдены два подкласса IgG: относительно медленно передвигающиеся в электрическом поле G₂ и более подвижные G₁ . Их молекулы имеют различные антигенные и биологические свойства, а также способность к перевариванию протеолитическими ферментами (Незлин, 1972).

Расшифрована первичная структура обеих цепей иммуноглобулина G₁ (Edelman, 1973). Тяжелые цепи его состоят из одной вариабельной области - V_H и 3 постоянных участков - Сн¹ , Сн² и Сн³ . Длину вариабельных областей составляют 114, а постоянных - 330 аминокислотных остатков, легкие из областей V₁ , СL.

С помощью электронной микроскопии (Valentine, Jreen, 1967), выяснено, что молекула иммуноглобулина G имеет V-образную форму, при этом Fab фрагменты образуют "лапки" молекулы , а Fc- фрагмент - ее "хвост". Она имеет два активных центра, находящихся в вариабельной части молекулы, а именно на кончиках Fab фрагментов.

При электрофорезе в щелочных значениях рН IgG передвига­ется медленнее всех сывороточных белков. При иммуноэлектрофорезе он образует вытянутую в дугу линию преципитации, прокры­вающую зону расположения b- глобулинов (Незлин, 1972). Нативная молекула IgG1 обычно не содержит свободных сульфгидрильных групп (Троицкий и др., 1965, Cristian, 1965). IgG содержит около 2,9% углеводов, которые находятся в тяжелых цепях (Незлин , 1968).

У человека только IgG способен проникать через плаценту и попадать в кровеносную систему плода, обеспечивая тем самым пассивный иммунитет новорожденных в ранний постнатальный пери­од (Брондэ, Рохлин, 1978).

б) Иммуноглобулины класса М. IgМ - один из высокомолеку­лярных белков сыворотки крови и имеет молекулярную массу около 1 млн, константу седиментации 19 Se. Молекула IgМ состоит из 5 субъединиц, каждая из которых напоминает молекулу IgG (рис. 2). Субъединица состоит из двух тяжелых и двух легких цепей с молекулярными массами 23 000 и 60 000 соответственно, m- цепь состоит из 5 доменов V_H , С¹ _m - С⁴ _m , легкая - изV_L , и С_L . Моле­кула 1IgM имеет 10 активных центров, расположенных в Fab облас­тях ( Прокопенко, Равич-Щербо, 1974, Литмен , Гуд, 1981).

IgМ содержит около 10% углеводов., функция которых обус­ловлена с образованием макромолекулы IgM из 7 S субъединиц к формированием пространственной структуры молекулы (Каверзнева, 1984). IgМ по рваному реагирует на восстановление 2- меркаптоэтанолом: при мягком он распадается на 5-7 S субъединиц, а при более глубоком на тяжелые и легкие полипептидные цепи.

Рис. 2. Схема строения молекулы IgМ

( из книги "Иммуноглобулины". -М.: Мир, 1981).

Радиальная упаковка субъедикиц IgМ, на одной из которых расположение гомологичных областей (доменов) L- (V_L .и С_L ) и H--цепей (V_H , С¹ _m , С⁴ _m ). Показаны наиболее важные продукты ферментативной фрагментации IgМ и предполагаемое положение J- цепи.

Важнейшее свойство молекулы IgМ, необходимое для ее функ­ционирования - конформационная подвижность при изменении усло­вий внешней среды (Каюшина и др., 1985, Свергун и др., 1585). При электрофорезе IgМ передвигается быстрее иммуноглобулинов класса G во фракции b₂ - глобулинов. Найдено 2 подкласса IgМ, с различными антигенными свойствами (Гауровец, 1969, Бернет, 1971, Незлин , 1972, Кульберг , 1975).

Не менее значительно нахождение его на поверхности b-лимфоцитов в качестве их основных рецепторов (Петров, 1987). IgM обнаружен у всех исследованных позвоночных (Koshland, 1975). У человека после 45 лет содержится 1,71 мг/мл IgМ или около 10% от общего количества иммуноглобулинов (Стефани, Вальтищев, 1977). IgM- антитело первичного иммунного ответа, так как синтезируется первым после антигенной стимуляции. Че­рез несколько дней синтез IgМ переключается на IgG, а позже -на IgА (Петров , 1987).

IgM в основном имеет внутрисосудистую локализацию, не­большое количество его обнаружено в тканевых жидкостях, но в слизистых выделениях он обычно отсутствует (Jonas, 1972). У большинства же животных (кроме кроликов) IgM через плаценту проходить не может ( Маслянко , 1973).

в) Иммуноглобулины класса А. IgA впервые идентифицирован в сыворотке крови человека иммуноэлектрофорезом как b₂ А-гло­булин (Burtin et al, 1957, Грабар, Буртэн, 1963).

Иммуноглобулин А- один из наименее изученных защитных белков человека и животных. Это объясняется исключительно низ­ким его содержанием в нормальной сыворотке крови, трудностями выделения, а также некоторым сходством с иммуноглобулинами класса 6 и другими белками неиммуноглобулиновой природы.

Существуют компоненты IgА с константами седиментации 7S, 11S, 13S, 15S5, 17S. В полимерных формах иммуноглобулина А (рис. 3) обнаружен дополнительный полипептид J цепь (Halpern, Koshland, 1970).

Рис.3 Строение молекулы IgA

(из книги Р. В. Петрова "Иммунология". -М.: Медицина, 1987).

SС- секреторный компонент; j- соединяющая; H-тяжелые; L-легкие цепи

В нормальной человеческой сыворотке найдены два антигенно различающихся подкласса IgA - А1 и А2 (Vaerman, Hereman, 1966, Kunkel, Prentergast, 1966, Feinstein, Franklin, 1966, Fomasi, Yrey, 1972). IgA2 существует в виде димеров, соединенных дисульфидной связью, а тяжелые и легкие цепи связаны нековалентными связями (Yrey et al, 1968, Незлин, 1982). Оба подкласса IgA обладают активностью антител (Dorrington, Fanford, 1970, Бернет, 1971). Молекулы IgА, содержащиеся в различных секретах - молоке, молозиве, пищеварительных соках, слюне, моче и т.д., имеют константу седиментации 11S и содержат дополнительную полипептидную цепочку- секреторный компонент с молекулярной массой 50 000 - 60 000 (Brandt et al, 1968, 1975, Fomasi et al, 1965, 1968).

Иммуноглобулины А слюны и пищеварительного тракта устой­чивы к действию протеолитических ферментов - пепсина и трип­сина (Ballierex et al, 1969, Porter, Noakes, 1970). Эта резистентность связана с присутствием секреторного компонента син­тезированного в выделяющей секрет железе и затем присоединен­ного к молекуле IgA с образованием димеров из двух его молекул (Стефани, 1973, Чернохвостова, 1974, Першин, 1980).

Поэтому в секретах IgA обычно находится в виде димеров или тримеров Гаврилова , 1976). Мономеры IgА имеют молеку­лярную массу 160 000. IgА у некоторых видов животных имеет более высокую электрофоретическую подвижность, чем IgМ. Содер­жание углеводов высокое -10%. Молекулярная масса в основном, одинакова с IgG1, а у некоторой части популяции молекул IgA она промежуточная между IgA и IgM. Как и у других иммуноглобулинов, восстановление приводит к распаду молекулы на тяжелые и легкие цепи. Характерны тяжелые цепи.

IgA в сыворотке крови человека содержится в относительно большем количестве, чем IgМ и составляет около 19% от общего количества иммуноглобулинов (Hobby, 1971). В сыворотке крови многих видов животных, в частности овец и крупного рогатого скота, IgM преобладает над IgA. Значительное количество этого белка обнаружено в лимфе, где концентрация его в 2-18 раз вы­ше, чем в крови (Стефани, 1971). Антитела найдены и в содержи­мом кишечника и фекалиях, 80% которых приходится на долю IgА. Антитела, выделяющиеся в кишечник в устойчивой к гидролизу форме, играют важную роль в защите организма от кишечных ин­фекций (Fomsi, Yrey, 1972). IgА находится на поверхности сли­зистых оболочек и активно участвует в местной иммунологической защите (Герберт, 1974).

г) Иммуноглобулины класса D. IgD также изучен недостаточно. Впервые он охарактеризован как четвертый класс иммуноглобулинов D.Rowe, G.Fahey (1965). Его молекулярная масса около 180000. Молекула IgD состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками (Vunnar, Fohansson, 1969, Spiegelberg, 1977, Ruddick, Leslie, 1977). Роль в организме человека почти не изучена. Полагают, что он - секреторный иммуноглобулин. Сывороточный IgD обнаружен только у человека и приматов. При электрофорезе в агаровом ге­ле подвижность IgD соответствует подвижностямb и a глобулинов. Точных экспериментальных данных о присутствии IgD у жи­вотных пока не имеется.

д) Иммуноглобулины класса Е. IgE впервые идентифицирован K. Ishisaka, F. Fshisaka (1966). Молекулярная масса IgЕ 190 000, константы седиментации 8 S. Молекула IgE также состоит из двух легких и двух тяжелых полипептидных цепей, молекулярная масса которых 22 600 и 72 500 соответственно. Содержание углеводов свыше 12% (Шаханина, Стоев, 1981). IgE играют важную роль в патогенезе аллергии (Isgizaka, Ishizaka, 1976, Dorrington, Bennich, 1978). К.Г.Стоев (1979) разработал методы выделения и количественного определения D и Е иммуноглобулинов в сыворотке крови здоровых и больных людей.

ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Для выделения иммуноглобулинов из сыворотки крови живот­ных, особенно G₁ , М и А, применяют различные методы получения предварительно очищенных белков, обогащенных соответствующими иммуноглобулинами. Дальнейшую очистку проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- сефадексе А-50, ДЭАЭ- целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацией на сефедексе G-200 или препаратным электрофо­резом.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОЧИЩЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

С этой целью обычно применяют методы предварительного вы­деления иммуноглобулинов.

ОСАЖДЕНИЕ 4 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА АММОНИЯ

4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки сыво­ротки, включая альбумин.

В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов G₁ и G₂ и значительное количество IgМ и IgА , хотя последние обычно обнаруживаются и в надсадочной жидкости. Поэтому оса­док, полученный 4 Мраствором сульфата аммония, может служить источником приготовления всех классов иммуноглобулинов, что име­ет большое значение, особенно для выделения их из одной пробы сыворотки.

ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ