Реферат: Методы разделения иммуноглобулинов

Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в 1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды промывают 1,39 М раствором аммония.

При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются иммуноглобулины G₁ и G₂ , однако иммуноглобулин G₁ , a- и b- глобулины присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей, главным образом выделяетсяиммуноглобулин G₂ , IgG(Т) присутствует лишь в небольшом количестве.

Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором суль­фата аммония путем диализа удобен для выделения IgG₂ из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, однако наиболее чистый IgG₂ получается из сыворотки крови лошадей.

ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ

К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холод­ный 2,53 М раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают 2 час в холодильнике, осадок раство­ряют и диализируют. 1 М раствором сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G₁ и G₂ , практически свободные от фракции b-глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и выгоден для выделения иммуноглобулинов G₁ и G₂ из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G₁ . По составу, препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому 1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для выполнения иммуноглобулина G₂ .

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50

Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ -сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями (Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).

Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле,где в зоне g -глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные g -глобулиновые фракции - IgG₁ и IgG₂ , а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG₁ , IgG₂ и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не получили чистые фракции IgG₁ и IgG₂ из сыворотки крови овец и крупногорогатого скота, а только их смесь.

Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработалиспособ выделения чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ -сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить иммунохимически чистый иммуноглобулин G₂ из сыворотки крови лошадей. Им удалось выделить смесь белков состоящую из IgG₂ и IgМ и IgА. Ана­логичные результаты получены при выделении IgG₂ из из нормальной сыворотки овец (Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).

Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому , обусловлены особенностями белковогосостава сыворотки крови этих видов животных. Таким образом,указанныйметод - также способ предварительного выделения IgG₂ из нормальной сыворотки крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение необходимо отметить, что американскому био­химику G.Edelman (1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия 1972 года. Присуж­дение Нобелевской премии указывает на большое внимание мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение оп­ределенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.

Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных живот­ных, то, к сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.

Главный защитный белок сельскохозяйственных животных IgG. Причем он существует в виде двух подклассов: G₁ и G₂ , ко­торые различаются аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, антигенным и биологическим свойствам. Однако вы­деление из сыворотки крови чистых препаратов IgG₁ - очень сложная, и следовательно, не до конца решенная проблема.

Поэ­тому большинство литературных данных по этому вопросу касается IgG и лишь немногие IgG₁ и IgG₂ .

IgM один из высокомолекулярных и сложноорганизованных белков сыворотки крови, состоящий из 5 субъединиц, соединенных лабильными дисульфиными связями. Этим и объясняется трудность его выделения и изучения. Хотя существуют несколько современ­ных методических приемов, помогающих его выделению, ни один из них в отдельности не обеспечивает получения чистого IgМ. Поэтому необходимо использовать комбинированные методы, основанные на особенностях его физико-химических свойств.

Так, до сих пор остается сложной задачей приготовление высокоочищенного IgМ, пригодного для изучения его структурных особенностей и аминокислотного состава, антигенных свойств, а также получение к нему моноспецифических иммунных сывороток. По-видимому, этим и объясняется отсутствие работ по изучению пептидной структуры и аминокислотного состава IgМ у различных видов животных. Относительно мало работ, выполненных с помощью моноспецифических иммунных сывороток к IgM у животных, особенно у лошадей и овец.

Однако особый интерес, особую сложность для выделения представляет IgА, в частности у жвачных - крупного рогатого скота и овец. Это прежде всего связано с его небольшим содержанием в нормальной сыворотке крови. IgА относительно хорошо изучен только у человека благодаря появлению гибридом и моноклональных антител.

Изучение IgА у сельскохозяйственных животных начато недавно. Так, не изучены его структурные особенности и амино­кислотный состав, слабо - электрофоретические, хроматографические и гель-фильтрационные свойства и молекулярные размеры.

Изучение иммунологического статуса животных методом радиальной иммунодиффуэии с использованием моноспецифических иммунных сывороток имеет практическое значение. Однако в настоящее время почти отсутствуют исследования по установлению уровня иммуноглобулинов у отечественных пород крупного рогатого скота, овец, лошадей и других сельскохозяйственных животных. Неизвестно также, как изменяется количественное соотношение иммуноглобулинов в зависимости от породы, пола, возраста, сезонов года и продуктивности животного. Пока мало исследованы иммуноглобулиновый спектр новорожденных и динамика содержания иммуноглобулинов в возрастном аспекте, особенно у лошадей и овец.

Изучение иммуноглобулинов человека показало, что во многих случаях нарушается биосинтез иммуноглобулинов, обусловли­вающий изменения нормального соотношения их в сыворотке. Такие исследования проведены только у человека и отсутствую у сельскохозяйственных животных. Пока не изучены и качественные и количественные изменения состава иммуноглобулинов при раз­личных заболеваниях инфекционного и инвазионного характера.

Слабо изучена природа иммунного ответа у вакцинированных животных, особенно крупного рогатого скота и овец. Многочисленные исследования общего белка и его фракций у различных животных проведены главным образом методом электрофореза на бумаге, который имеет ограниченную аналитическую возможность. Это справедливо в отношении динамики белковых фракций сыворот­ки крови у молодняка сельскохозяйственных животных в возраст­ном аспекте, а также иммуноглобулинового, белкового и казеино­вого состава молозива и молока овец и лошадей.

Таким образом, исследование иммунохимических особенностей и количественного содержания иммуноглобулинов сельскохо­зяйственных животных имеет как теоретическое, так и практи­ческое значение.

ЛИТЕРАТУРА

1. Басова Е.Н., Стефани Д.В. Некоторые особенности выделения миеломных IgG человека различных субклассов и их распределение по аллотипам, субклассам и типам легких цепей// Журн. микробиолог. - 1977. - №5. - С. 77-81.

2. Басова Е.Н., Стефани Д.В., Казанцева Л.З. Иссчледования субклассов IgG человека. Сооб.II. Уровни отдельных субклассов IgG в парных сыворотках крови жителей северного села - изолята// Журн. микробиолог. - 1979. - №7. - С. 35-39.

3. Бернет Ф. Клеточная Иммунология. - М.: Мир, 1971. - 549 с.

4. Edelman J.M. Antibody structure and molecular immunology//Nobel lecture. Dec. 12 1972; Stocholm, 1973. - p. 147-170

5. Heimer R., Clark L.C., Mourer P.H. Immunoglobulins of sheep//Arch. Biochem. Biophys. - 1969 - v.131. - p. 9-17.

6. Kehoe J.M., Tomosi T.B., Ellous F., Capra J. Identification of J-chain in a homogeneous canine IgA immunoglobulin//J. Immunol - 1972 - v.109 - p.59-64.

7. Menta P.D., Reichin M. Comparative studies of vertebrate immunoglobulins//J. Immunol - 1972 - v.109 - p.1272-1277.

8. Ж.Ж.Жумашев, М.Б.Бабаев, Ш.С.Алимжанова, М.А.Туганбекова. Иммуноглобулины животных. Алматы. 1994.