Реферат: Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка згідно плану науково-дослідної роботи кафедри за темами: “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держреєстрації 0193U024092) і “Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).
Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було з’ясування біохімічних механізмів впливу системи L-аргінін/NO на морфологічний та функціональний стан еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень, які виникають при даній патології.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
1. Оцінити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.
2. Дослідити активність NO-синтази в еритроцитах щурів у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам peros субстрату даного ферменту (L-аргініну) та його інгібіторів (L-NAME (Nщ –nitro-L-arginine methyl ester) і аміногуанідину (AG)).
3. З метою дослідження процесів депонування NO вивчити динаміку вмісту лігандних форм гемоглобіну (Hb) в еритроцитах, кисень-зв’язуючу функцію основного пігмента крові, нітритредуктазну активність дезокси-Hb та процес нітрозування Hbinvitroв нормі, за умов експериментального ЦД та на фоні введення AG.
4. Проаналізувати електронні спектри нітрозил-Hb (NOHb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG для оцінки можливості моделювання коригуючого впливу на процеси депонування NO.
5. За допомогою скануючої електронної мікроскопії дослідити поверхневу архітектоніку та поліморфізм еритроцитів щурів при введенні L-аргініну, L-NAME та AGinvivo у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу.
6. З’ясувати вплив L-аргініну, L-NAME та аміногуанідину на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.
Об'єкт досл i дження : біохімічні механізми, що опосередковують морфологічні та функціональні зміни в еритроцитах контрольних щурiв та тварин із експериментальним цукровим діабетом.
Предмет дослiдження : цитологічні та фізико-хімічні показники клітин еритроїдного ряду периферичної крові та кісткового мозку, ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та індуцибельна NO-синтаза), лігандні форми гемоглобіну, NO-похідні гемоглобіну (нітрозо- та нітрозилгемоглобін), нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну, ферментативна система антиоксидантного захисту (СОД, каталаза, ГПО, ГР), рівень продукції перекисного окислення ліпідів (ТБК-позитивні продукти).
Методи досл i дження : біохімічні, методи абсорбційної спектроскопії, скануючої електронної мікроскопії, цитологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості еритроцитів у периферичній крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.
Показано, що за умов експериментального ЦД значно зростає активність іNOS у еритроцитах.
Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та при ЦД 1-го типу на фоні введення аміногуанідину – інгібітора індуцибельної ізоформи NOS та процесів неферментативного глікозилювання. Показано, що за умов ЦД інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.
Вперше показано коригуючий вплив аміногуанідину на кисеньтранспортну систему, активність ферментів антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані по коригуючому впливу аміногуанідину на морфофункціональний стан еритроцитів (поліморфізм червоних кров’яних клітин, вміст глюкози та глікозильованого гемоглобіну, кисеньтранспортну функцію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту, депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання гемоглобіну) за умов ЦД 1-го типу вказують на доцільність його застосування в комплексній терапії та корекції ускладнень, що виникають при досліджуваній патології і на його основі вести пошук та розробку нових фармакологічних препаратів для лікування даного захворювання. Результати досліджень нітритредуктазної активності, процесів нітрозилювання та нітрозування дезоксигемоглобіну in vitro та аналіз електронних спектрів нітрозилгемоглобіну дозволяють охарактеризувати механізми депонування NO за участю гемоглобіну та роль системи L-аргінін/NO у процесах формування адаптаційного захисту при ЦД.
Отримані у дисертаційній роботі дані використовуються у навчальному процесі під час викладання спецкурсів, які читаються на кафедрі біохімії біологічного факультету Л НУ імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень дисертант безпосередньо брала участь у створенні моделі стрептозотоцинового діабету, виконала весь обсяг експериментальних досліджень, статистичну обробку отриманих результатів, здійснила пошук та аналіз джерел наукової літератури згідно з темою кандидатської дисертації. Автор особисто брала участь у підготовці публікацій до друку. Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів методом скануючої електронної мікроскопії виконано спільно із к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів, формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником, д.б.н., завідувачем кафедри біохімії, проф. Сибірною Н.О. Співучасть співробітників кафедри біохімії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на IV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); І з’їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції „Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006); ІХ З’їзді Укр. біохім. тов. (Харків, 2006); третій Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”(Львів, 2007); 2-му З`їзді Українського Товариства Клітинної Біології (Київ, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, які включають 6 статей у фахових наукових журналах та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях, з’їздах, конгресах.
Структура та обсяг роботи. Дисертація містить наступні розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 124сторінках друкованого тексту і проілюстровано 12 рисунками та 13 таблицями. Список літератури включає 177 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані стосовно етіології ЦД 1-го типу та його ускладнень, а також експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано морфофункціональний стан системи еритрону, киснево-транспортну функцію крові та біологічну систему L-аргінін/NO у нормі і за умов досліджуваної патології.
Матеріали і методи досліджень. Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) у щурів викликали введенням стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла дочеревинно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали глюкозооксидазним методом з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини з питною водою: L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах: 1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-аргінін; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG.
Кількість еритроцитів та ретикулоцитів визначали згідно методик [Сибірна та ін., 1997]. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів визначали за методикою, описаною [Ілюхін и др., 1982 ]. Для отримання цитологічних препаратів клітин кісткового мозку застосовували комбіноване фарбування за Папенгеймом.
Активність NO-синтази визначали як описано в роботах [Онуфриев, 1995, Сумбаев, 2000] у нашій модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967].
Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий та ін., 1998]. Нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну визначали у гемолізатах, отриманих з використанням 33 мМ К+ /Na+ -фосфатного буферу (рН 7,36). Процес дезоксигенації гемоглобіну здійснювали у вакуумі [Иванов, 1975] і контролювали спектрофотомерично. Концентрацію гемоглобіну у гемолізатах визначали за методикою [VanKampen, 1961]. Реакцію відновлення NO2 - аніонів за участю дезоксигемоглобіну ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO2 та реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм [Gross, 1999]. Електронні адсорбційні спектри досліджували за допомогою спектрофотометра UV-VIS “SpecordM-40” (Німеччина). Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів та аскорбінової кислоти [Gross, 1999].
Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів здійснювали методом скануючої електронної мікроскопії. Виділення, відмивання та фіксацію еритроцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Сидоров и др., 2001, Новицкий и др., 2001]. Готові зразки вивчали в скануючому електронному мікроскопіJEOLJSM-T 220 AScanningmicroscope (Японія) Для отримання кількісної характеристики морфологічних форм еритроцитів у кожному препараті статистично підраховували 500 клітин, використовуючи класифікацію [Боднарь и др., 2003, Погорелов и др., 2005].