Реферат: Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу

Результати досліджень обробляли статистично з використанням коефіцієнта Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитологічні та фізико-хімічні показники периферичної крові та кісткового мозку щурів у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу . Показано, що за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) відбувається збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові у 1,4 разів, їх добової продукції у 1,3 разів, а швидкості дозрівання у півтора рази порівняно до норми. Розвиток стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого та глікозильованого гемоглобіну (Hb). Збільшення кількості фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією системи еритрону на гіпоксичний стан, який розвивається за умов ЦД. При аналізі цитологічних препаратів кісткового мозку виявлено зниження процентного вмісту поліхроматофільних (у 1,3 разів) та оксифільних (у 1,7 разів ) нормоцитів при стрептозотоциновому діабеті, яке можна пояснити їх сповільненим дозріванням та швидкими темпами елімінації ретикулоцитів у русло крові. Отримані нами результати ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Згідно даних, приведених в табл.1, введення L-аргініну у нормізбільшувало NO-синтазну активність еритроцитів приблизно на 30%. L-NAME – структурний аналог L-аргініну та неспецифічний інгібітор, який конкурентно інгібує всі форми NOS, знижував активність досліджуваного ферменту на 29%, а дія аміногуанідину – селективного інгібітора іNOS, була дуже слабкою. За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-аргініну викликало зниження активності NOS. Це можна пояснити інгібуванням активності ферменту за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. При введенні інгібіторів при ЕЦД спостерігалося пригнічення активності NOS в еритроцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології.

Табл. 1

Активність NOS і вміст нітритів та нітратів в еритроцитах периферичної крові за досліджуваних умов ( М±m, n=14)

Показники Умови	Активність NOS, пмольNADPH/хв на 1мг білка	NO3 - + NO2 - , мкM
Контроль	0,831 ± 0,028	15,732 ± 2,173
Контроль + L–аргінін	1,080 ± 0,098*	22,322 ± 2,078*
Контроль + L-NAME	0,590 ± 0,041*	6,459 ± 0,024*
Контроль + AG	0,673 ± 0,051*	14,654 ± 1,354
ЕЦД	1,288 ± 0,101*	33,623 ± 1,799*
ЕЦД + L–аргінін	0,843 ± 0,070**	26,924 ± 1,852**
ЕЦД + L-NAME	0,360 ± 0,033**	7,164 ± 0,709**
ЕЦД + AG	0,450 ± 0,039**	11,198 ± 1,215**

Примітка. Тут і далі:

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

** - різниця вірогідна порівняно із діабетом, р<0.05

При аналізі вмісту стабільних метаболітів NO – нітратів та нітритів ми отримали результати, які підтверджують дані змін активності NOS, визначеної прямим методом (табл.1).

Вплив аміногуанідину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну за умов ЦД 1-го типу. Проведено дослідження впливу аміногуанідину на вміст лігандних форм, спектральні характеристики, нітритредуктазну активність гемоглобіну та кисеньтранспортну функцію еритроцитів. З метою виявлення факторів, які могли б впливати на кисневу афінність гемоглобіну і функціонування киснево-транспортної системи організму в цілому був проведений аналіз лігандних форм гемоглобіну крові щурів у нормі та за умов ЕЦД при введенні AG з використанням методу абсорбційної спектроскопії. В результаті проведених експериментів ми зареєстрували достовірне зростання вмісту метгемоглобіну за умов ЦД. Введення in vivo AG – як у нормі так і за умов цукрового діабету викликало зниження метгемоглобіну, що може свідчити про те, що зростає роль нітритредуктазної ланки оксиду азоту. Для того з’ясування механізмів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го типу було досліджено процес нітрозування Hbinvitro, а також проаналізовано електронні спектри дезокси-Hb та нітрозил-Hb (NO-Hb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG. Поступове перетворення дезокси-Hb в NO-Hb спостерігали за характерними змінами поглинання у видимій області спектру (рис.1). Широка асиметрична смуга з максимумом при 555-560 нм замінялася двома смугами із максимумами поглинання 545,8 нм та 572,4 нм, які є характерними для нітрозил-Hb [Van Kampen, 1983]. Час переходу дезокси-Hb у NO-Hb за умов стрептозотоцинового діабету зростав приблизно на 70%. Електронний спектр (рис.2, крива 2) нітрозил-Hb тварин із стрептозотоциновим діабетом в порівнянні з NOFe²⁺ Hb контрольних щурів характеризувався гіпсохромним ефектом у межах смуги Соре. Ці зміни у електронному спектрі Hb зумовлені перерозподілом електронної густини у системі спряжених зв’язків протопорфіринового макроциклу і атома заліза. У вихідній дезоксигенованій формі гемоглобіну Fe²⁺ знаходиться у високо-спіновому стані, має координаційне число 5 і міститься за площиною гему на відстані 0,07нм. При взаємодії оксиду азоту з атомом Fe²⁺ у шостому координаційному положенні залізо переходить у низько-спіновий стан, а число лігандів у координаційній сфері збільшується до шести.

Перехід у низькоспіновий стан супроводжується його зміщенням на 0,07 нм у площину гему, що спричиняє поетапний розрив сольових зв’язків між б-субодиницями і зміщенням субодиниць уздовж контактів б1-в2 і б2-в1.

Нітрозування дезокси-Hb щурів із стрептозотоциновим діабетом супроводжувалось гіперхромним ефектом в області поглинання ароматичних амінокислот, що реєструвалося як зміщення максимуму поглинання з 268,3 до 274,9 нм, і появою широкої смуги поглинання при 334 нм порівняно з NO-Hb контрольних тварин. Зміни спектру поглинання в ультрафіолетовій області відбуваються за рахунок взаємодії NO з білковою частиною молекули Hb, адже відомо, що при 320-360 нм поглинають світло S-нітрозотіольні похідні білків [Stamler, 1992]. Очевидно, відбувається утворення SNO-Hb, який є продуктом нітрозилюванням в-93 цистеїну. Спектри нітрозо-Hb контрольних та з ЕЦД типу щурів, які представлені на рис.2, свідчать про те , що введення AG in vivo (крива -3) мало нормалізуючий вплив на фізико-хімічні властивості молекули Hb.

При дослідженні нітритредуктазної ланки утворення NO за участю дезоксигемоглобіну за умов цукрового діабету виявлено що дезоксигемоглобін щурів із ЕЦД виявляє відносно більшу нітритредуктазну активність порівняно з дезокси-Hb контрольних щурів. Введення AG практично не змінювало досліджуваних нами показників у контрольних тварин. Проте, у тварин з ЕЦД показано зниження нітритредуктазної здатності дезокси-Hb за введення AG, про що свідчить зниження інтенсивності процесів нітрозилювання дезокси-Hb.

При аналізі кривих дисоціації оксигемоглобіну (КДО) отримано чітко виражений зсув кривої дисоціації вліво і зниження Р₅₀ у щурів з ЕЦД (рис. 3). Виявлено також достовірне зростання вмісту глікозильованого гемоглобіну, що є одним з факторів, що викликає ці зміни (табл. 2). Введення AG контрольним щурам викликає зсув КДО вправо порівняно з контролем, що свідчить про зменшення спорідненості гемоглобіну до кисню (Р₅₀ =29,31±1,39). При дії AG за умов ЕЦД нормалізуються киснево-транспортні функції гемоглобіну, тобто відбувається зсув КДО вправо порівняно з діабетом і наближення до контролю (рис. 3), вміст глікозильованого гемоглобіну при цьому достовірно зменшується (табл. 2). При введенні аміногуанідину за умов ЕЦД зсув КДО вправо вказує на перерозподіл у співвідношенні : MetHb / HbFe²⁺ NO / SNO-Hb в сторону утворення HbFe²⁺ NO.

Табл. 2.

Напівнасичення гемоглобіну киснем та вміст глікозильованого гемоглобіну

(̱m, n=8-10)

Варіант досліду	Р 50, мм рт. ст..	Вміст Hb Ac, %
Контроль	26,61±2,11	4.53 ± 0.05
Діабет	19,20±1,60*	8.81 ± 0.41*
Контроль + AG	29,31±1,38	4.49 ± 0.07
Діабет + AG	23,31±1,08**	6.03 ± 0.28**

Тобто відбувалось зниження спорідненості гемоглобіну до кисню та полегшення дисоціації оксигемоглобіну і гіпоксичного стану, що виникає при даній патології.

Поліморфізм еритроцитів периферичної крові у нормі та за умов цукрового діабету 1-го типу на фоні впливу L-аргініну та інгібіторів NO-синтази

Результати досліджень поверхневої архітектоніки еритроцитів щурів в нормі та за умов ЕЦД на фоні впливу основного субстрату та інгібіторів NO-синтази представлені на рис. 4, 5. Отримано достовірні дані про кількість дискоцитів, стоматоцитів (клітини, які мають форму округлого диску з вираженою увігнутістю з одного боку), ехіноцитів (еритроцитів з виростами різної форми) і форми еритроцитів, які важко піддаються класифікації (табл. 3).

В нормі еритроцитарний пул представлений в основному двовігнутими дискоцитами (рис. 4) до 97%. Клітинна поверхня дискоцита у скануючому мікроскопі виглядає зглаженою, без рельєфних утворень. Трансформовані форми еритроцитів зустрічаються дуже рідко (3% від усієї кількості клітин). Серед них трапляються дискоцити з виростами, гребенями (ехіноцити), куполоподібні (стоматоцити), дзвоноподібні еритроцити. Це є морфологічним проявом онтогенезу червоних кров’яних клітин. Потрібно відмітити, що у контрольних щурів не виявлено значних змін у поверхневій архітектоніці еритроцитів за умов впливу основного субстрату – L-аргініну та інгібіторів NO-синтази (AG, L-NAME) (рис.4).

Аналізуючи поверхневу архітектоніку еритроцитів щурів при ЕЦД (рис 4, Д, рис. 5), можна побачити, що вони зазнають значних змін. На фоні зменшення чисельності популяції функціонально повноцінних двовігнутих дисків (до 69,72 ±2,18 %) спостерігалось збільшення кількості трансформованих клітин, що знаходяться на різних стадіях дегенерації.

Рис. 5. Окремі дегенеративні форми еритроцитів щурів за умов експериментального ЦД: А, Б, В, Д – еритроцити з гребнями різної форми; Г – дзвоноподібний еритроцит; Е, Є – еритроцити з поодинокими виростами; Ж, З – еритроцити з багатьма виростами.

Це еліпсовидні клітини, клітини у вигляді плоского диску, дискоцити з гребенем, виростами, сферичні, куполоподібні, дзвоноподібні, еритроцити у вигляді спущеного м’яча, дегенеративно-змінені клітини червоної крові, які важко піддаються класифікації. Різноманітність дегенеративних форм еритроцитів, виявлених нами за умов ЕЦД представлена на рис 5. Відмічено достовірне зростання концентрації глюкози та HbAc (табл.3).

Табл.3.

Рівень глюкози та вміст глікозильованого гемоглобіну при введенні досліджуваних речовин щурам у нормі і за умов експериментального цукрового діабету (М±m, n=14)

Варіант досліду

« 1 2 3 4 » К-во Просмотров: 151 Бесплатно скачать Реферат: Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу >>> Скачать <<< Меню Поиск