Реферат: Оценка стратегий размножения и поддержания жизнеспособности оомицета Phytophthora infestans в
изолята
1 возраст культур с наименьшей чувствительностью установлен достоверно, P>0,99;
2 возраст культур с наименьшей чувствительностью установлен на уровне тенденции, P>0,65;
3 возраст, при котором отмечена наименьшая чувствительностью культур, не установлен, P<0,65.
При последовательном пассировании на средах с Ширланом при втором пассаже рост был крайне ограничен, с развитием прижатого мицелия, на третьем пассаже способность к росту терялась у всех изолятов P . infestans . На средах с Амистаром такой результат наблюдали для изолятов ДТП10.1 и ВалС13. У изолята Д13 происходило существенное повышение чувствительности. Напротив, у изолята ВалС15 чувствительность к Амистару значительно не изменялась. На средах с Ридомилом выявили разные направления изменения чувствительности.
При перекрестном пассировании наблюдали резкое повышение чувствительности, если использовали среды с Ширланом (для всех изолятов) или Амистаром (для всех изолятов, кроме ВалС15). Если при первом и / или втором пассаже использовали среды с Ридомилом, то во многих случаях наблюдалось понижение чувствительности. Наименее эффективными последовательностями фунгицидов оказались: Ридомил®Ридомил®Амистар, Ридомил®Амистар®Ридомил. Однако было выявлено несколько исключений. Так, изолят ВалС15 резко понизил чувствительность к Ширлану после двух пассажей на среде с Амистаром. Изоляты ВалС13 и ВалС15 понизили чувствительность к Амистару после двух пассажей на среде с Ридомилом. Изоляты Д13 и ВалС15 понизили чувствительность к Амистару после пассажей на средах с Ридомилом и Ширланом.
Обсуждение результатов. Наше исследование четко показало, что популяции P . infestans включают группы штаммов с разной устойчивостью к фунгицидам. Наличие штаммов с повышенной устойчивостью к одному или двум фунгицидам (в том чиле и контактным) – это потенциальная опасность для стратегий антирезистентности. Также важно отсутствие обратных корреляционных взаимосвязей между агрессивностью и устойчивостью к различным фунгицидам.
По мере инкубации изолятов P . infestans определенной тенденции изменения чувствительности к фунгицидам выявлено не было.В полевых условиях преимущество могут получить изоляты, способные не уменьшать определенный уровень толерантности к фунгицидам до начала обработок.
Ооспоры P . infestans
Изучая ооспоры P . infestans , мы стремились изучать их в природе, в растениях-хозяевах, инфицированных естественным путем, и учитывали, что ооспоры могут иметь гибридное и негибридное происхождение.
Материалы и методы. 90 популяций P . infestans (групп природных образцов растений-хозяев, пораженных фитофторозом, собранных в одном месте в течение одного вегетационного сезона) исследовали на встречаемость в них ооспор. Популяции образцов собирали в 14 регионах России: Москве, Московской, Ленинградской, Новгородской, Ярославской, Тульской, Брянской, Калужской, Тамбовской, Рязанской и Томской областях, Мордовии, Северном Кавказе, Ставропольском крае в 1997–2008 г. Количество собираемых образцов (листьев картофеля, листьев томата или плодов томата) зависело от размера изучаемой популяции: от 4 (из несколько растений-хозяев) до 80–100 (из довольно крупных массивов. Методы работы с ооспорами рассмотрены в работах А.Н. Смирнова и С.А. Кузнецова (Смирнов, Кузнецов, 2006).
Результаты. Ооспоры обнаружили как в листьях картофеля, так в листьях и в плодах томата. Их встречаемость была неодинаковой (χ2 = 398,0 при 6 степенях свободы; критическое значение χ2 =12,6). Количество образцов листьев картофеля с ооспорами было низким, листьев томата – выше. Самым большим было количество образцов плодов томата с ооспорами (табл. 4).
Таблица 4. Встречаемость образцов с ооспорами P . infestans
| Происхождение образцов (растение-хозяин) | Общее коли-чество образ-цов | Число и процент образцов | |||
| в которых ооспоры не обнаруже-ны | с редкой встречае-мостью ооспор | с умеренной встречае-мостью ооспор | с частой встречае-мостью ооспор | ||
| Картофель листья | 2888 | 1405 (95,6%) | 86 (3,0%) | 25 (0,9%) | 13 (0,5%) |
| Томат листья | 344 | 165 (88,1%) | 19 (5,5%) | 13 (3,8%) | 9 (2,6%) |
| Томат плоды | 445 | 290 (71,2%) | 48 (10,8%) | 28 (6,3%) | 52 (11,7%) |
Редкая встречаемость – не более 25 ооспор, умеренная – 26–250 ооспор, частая – более 250 ооспор в 50 полях зрения микроскопа (1 мм2 ).
По четырем исследуемым признакам (диаметр, толщина стенки, наличие антеридия и форма оогония) в образцах 1999 г. выявили 40 морфологических типов ооспор. Среди них выявлено две большие группы. Первая представлена ооспорами типичной морфологии. Их диаметр (21 – 40 мкм) и форма (тяготеющая к шаровидной) были близки к типовым показателям (рис. 3). Вторая представлена ооспорами нетипичной морфологии (рис. 4). Их размер (15 – 20 мкм или 41 – 55 мкм) или форма (уклоняющаяся от шаровидной) отличались от характеристик ооспор типичной морфологии.
Анализы морфологии обнаруженных ооспор и соотношения типов спаривания мицелиев, их образующих, показали, что около 61% (от 31% до 83%) всех обнаруженных ооспор в 1999 г. имели негибридное происхождение. Доля гибридных ооспор составила лишь 2% (от 0% до 7%). Происхождение остальных ооспор было спорным. Совместное присутствие А1 и А2 в образцах не всегда приводило к образованию в них ооспор.
Добавление фунгицида Ридомил в среду оказывало сильный угнетающий эффект на образование гибридных ооспор.
Определение жизнеспособности ооспор P . infestans до и после перезимовки показало, что после перезимовки большинство ооспор (от 50% и выше) сохранили свою жизнеспособность (табл. 5).
Таблица 5. Количество жизнеспособных ооспор от скрещивания изолятов А1 и А2 на ржано-томатном агаре и в плодах томата, определенная на основе плазмолизного теста, до и после перезимовки
| Годы | Количество жизнеспособных ооспор, % | |||
| от скрещивания изолятов А1 и А2 на ржано-томатном агаре | в плодах томата | |||
| до перезимовки | после перезимовки | до перезимовки | после перезимовки | |
| 2004–2005 | 60–70 | 60–80 | 80–90 | 60–85 |
| 2005–2006 | 57–70 | 32–44 | 90–100 | 28–50 |
| 2006–2007 | 90–95 | 69–90 | 52–94 | 69–90 |
Изучение прорастания ооспор дало следующие результаты.
За месяц инкубации скрещенных изолятов с примесью триходермы в районе скрещивания образовалось много нетипичных ооспор, до 80% которых прорастало короткой ростковой трубкой. Типичные ооспоры почти не прорастали.
Ооспоры от скрещиваний А1 и А2 на ржано-томатной среде и после перезимовки прорастали ростковой трубкой с частотой от 20 до 35%. Природные ооспоры из плодов томата прорастали с частотой, не превышающей 3%.
Дополнительный тест показал, что наибольшее влияние на прорастание типичных ооспор оказала обработка суспензией из мицелия и спор триходермы. Действие отрицательной температуры также усиливало прорастание ооспор.
Инокуляция суспензией ооспор ломтиков картофеля во влажных камерах не привело к их заражению. Нанесение ооспор на прорастающие клубни не привело к заражению выросших растений.
При заражении проростков томата установили, что они могут поражаться фитофторозом через почву, в которой содержатся ооспоры (или зооспорангии) P . infestans в условиях, ослабляющих иммунитет растения. Однако более вероятно, что при этом проростки поражаются комплексом болезней по типу корневых гнилей, поражающих зародышевый корешок и гипокотиль. Фитофтороз входит в этот комплекс.
В полевом эксперименте, при нанесении суспензии ооспор на семенные клубни, массового поражения растений не обнаруживали. Исключением был очаг на сорте Дельфин (Лаборатория защиты растений РГАУ-МСХА, 2006 г.).
Обсуждение результатов. Максимальное количество ооспор мы наблюдали в плодах томата. Справедливо утверждение, впервые сформулированное С.А. Кузнецовым, что в условиях Московской области плоды томата – это своеобразная «маленькая Мексика» (Смирнов, Кузнецов, 2005; Smirnovetal., 2008; Smirnov, Kuznetsov, 2009).
Мы полагаем, что в большинстве современных полевых популяций P . infestans могут образовываться ооспоры всех трех типов по происхождению. Тип образуемых ооспор может в значительной степени регулироваться внешними факторами и условиями существования полевых популяций патогена (Turkensteenetal., 2000). Инфекционный цикл P. infestans включает в себя несколько стратегий (Дьяков, 1992; 1998). Зооспоры и зооспорангии соответствуют r‑стратегии (размножение, низкая сопротивляемость), гибридные ооспоры – К-стратегии (жизнеспособность, высокая сопротивляемость) (Дьяков, 1992). Ооспоры от самооплодотворения и партеногенетические ооспоры соответствуют промежуточным стратегиям. Первые ближе к К-стратегии, вторые находятся между r- и К-стратегиями (Смирнов, 2003а).
Проведенные нами лабораторные и полевые эксперименты стали еще одним косвенным подтверждением того, что гибридные ооспоры могут иметь значительное инфекционное значение, которое, однако, может реализовываться не сразу, а в последующих вегетационных сезонах. Прямое исчерпывающее доказательство этого с использованием молекулярно-генетических маркеров RFLP получено в Голландии в начале 1990‑ых годов (Drenthetal., 1994).