Реферат: Получение трансгенных животных

РНК векторной конструкции, наоборот, содержит сигнал узнавания ψ и поэтому может быть упакована в рибонуклеопротеидный комплекс. Таким образом, происходит формирование инфекционных вирусных частиц, содержащих информацию ретровирусного вектора и переносящих ее в инфицируемые клетки. Однако такие вирусные частицы не способны к образованию новых вирусов, так как в инфицируемой клеточной линии отсутствует генетическая информация о структурных белках, необходимых для формирования вирусных частиц.

Необходимыми составными частями векторной конструкции являются 5' и 3' LTR, а так же сигнал упаковки, расположенный "вниз по течению" от 5' UTR. Экспрессия трансгена направляется промотором и энхансером 5' UTR или альтернативными вирусными или клеточными промотерами (например, вирус саркомы Рауса, тирозин, α-казеин). Впервые присутствие вирусной ДНК в клетках взрослых мышей установлено в 1974 году. Ретровирусные векторы могут служить альтернативой для эффективного транспорта генов у сельскохозяйственных животных. Инфекция зигот или предимплантационных эмбрионов в большинстве случаев приводит к получению трансгенных животных-мозаиков. Объяснением этому служить то, что интеграция происходит только в том случае, если клетка вступает в митоз после предварительной репликации ДНК. Все потомки, родившиеся из инфицированных ооцитов, были трансгенными {табл. 1). Не смотря на ограниченное число полученных трансгенных животных, были доказаны передача трансгена по наследству и экспрессия рекомбинантного продукта.

Эффективность получения трансгенного КРС с использованием ретровирусной инфекции ооцитов в метафазе II второго мейотического деления.

Показатели	Число (n)	%
Инфицированные ооциты	836
Эмбрионы, развившиеся до бластоцисты	174	21
Пересаженные эбрионы	10
Живые потомки (% от пересаженных эмбрионов)	4	40
Трансгенные животные (% от родившихся потомков)	4	100

Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусами.

Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п. н. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интроннные последовательности, которые как и другие дистальные или проксимальные последовательности играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенноых животных [Palmiter et ai, 1991]. К недостаткам использования ретровирусных векторов следует так же отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации вирусных промоторов в клетках, например, посредством а- и у-интерферонов, действующих на вирусные LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт (IRES) [Salen, 1997] и тетрациклиновая регуляторная система [lida et ai, 1996].

Еще одним ограничением использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является их низкий титр. Обычные ретровирусные векторы имеют титр 1 х 105-6 колониеобразующих единиц (cfu) в мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы их введения в эмбрионы. Проблема низкого титра была недавно решена посредством разработки нового вектора на основе вируса везикулярного стоматита (псевдотип VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Известно, что тропизм ретровируса определяется геном env, поэтому его замена в векторе на ген env другого ретровируса может расширить спектр хозяев и изменить свойства ретровируса. Данная технология получила название псевдотипирования. Включение белка вируса везикулярного стоматита С в вектор на основе Мо – MLV (Burns et al,1994) позволило сделать его более стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован до титра 1x109-10 КОЕ/мл и имеет очень широкий спектор клеток-хозяев. С его использованием были получены трансгеные лини клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение трансгенных животных посредством инъекции содержащей вирусы среды в перивителиновое пространство [Chan et al, 1998)/ В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании вируса с титром 1*10 9-10 КОЕ/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению в перивителиальное пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1*105-6 КОЕ/мл, то для введения в эмбрион одной вирусной частицы понадобилось не менее 1 нл раствора .

К недостаткам использования ретровирусов относится возможность клеточных онкогенов посредством вирусных транскрипционных последовательностей. Даже при применении ретровирусов, которые не могут существовать как инфекционные вирусные частицы, существует хотя и очень небольшой, но риск, что при рекомбинации с присутствующими в эмбрионах эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов.

Не смотря на перечисленные недостатки и ограничения, ретровирусы могут быть широко использованы для трансгенеза в животноводстве. Успешное введение генетического материала в ооциты делает возможным проведение генной терапии наследственных заболеваний. Использование ретровирусных векторов позволяет осуществлять трансформацию отдельных органов. Так, Archer с соавторами [1994] ввели в молочную железу козы путем инфузии через сосковый канал в период гормонально индуцируемого маммогенеза ретровирус, кодирующий гормон роста человека (hGH). Лактация наступила на 14-ый день гормональной обработки. Максимальный уровень hGH (60 нг/мл) наблюдался в первый день лактации и затем опускался до 12 нг/мл на 9-12 дни лактации.

Аналогичные эксперименты с использованием экспрессионного вектора pLNS, полученного на основе Mo-MLV проводятся в отделе биотехнологии Всероссийского НИИ животноводства.

LTR – длинный концевой повтор , ψ+ - сигнал упаковки, Н4 – промотер гистона человека, NEO – ген устойчивости к неомицину,ЕР – делеция в области промотера-энхансера, рА – сигнал полиаденилирования Данный вектор содержит только цис-действующие последовательности генома вируса, необходимые для репликации. Последовательности вируса, кодирующие белки, исключены из векторной конструкции. Вектор содержит 5' длинный концевой повтор LTR, с которого происходит транскрпция, ψ+ область, ответственную за упаковку вирусного генома в вирион, ген устойчивости к неомицину, под контролем промотера Н4 гистона человека для селективного введения конструкции в клеточную линию и 3' LTR с делецией в области промотера-энхансера вируса. После одного цикла репликации делеция в области ЕР LTR будет присутствовать на обоих концах провируса, регуляторные элементы провируса будут полностью инактивированы и клонированные гены будут экспрессироваться только под контролем собственных промотеров.

Доказана возможность успешной инфекции альвеолярных клеток молочной железы свиней и коров рекомбинантными ретровирусами..

Инфекция молочной железы не носит локального характера. Последовательности провируса помимо опытных долей вымени были выявлены в контрольных долях молочной железы, в слюнной железе, селезенке, поджелудочной железе, спинном мозге, надпочечниках. ИФА молока свиней выявил наличие рекобинантного продукта в количестве от 30 до 290 нг/мл.

Основными недостатками метода непосредственной инфекции отдельных органов животных является необходимость использования большой дозы ретровирусов с тем, чтобы инфицировать достаточное число клеток, а так же невозможность передачи трансгена по наследству следующему поколению животных. Однако в отличие от введения грансгенов в эмбриональные линии, данный подход позволит синтезировать рекомбинантные продукты в молоко уже через несколько месяцев после начала эксперимента. Для КРС по сравнению с традиционным методом микроинъекции затраты времени от начала эксперимента и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются, соответственно, с 4-5 лет до 4 5 месяцев.

1.3 Метод пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro

Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Впервые экспрессия генных конструкций в соматических тканях химерных мышей, полученных с использованием трансформированных клеток эмбриональной карциномы, была доказана Stewart с соавторами [1985]. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген по наследству. Однако в настоящее время наибольшее распространение для получения химерных животных получили эмбриональные стволовые клетки, ЭСК [Robertson et al., 1986]. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам приведет к рождению только трансгенного потомства. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК делает возможным в ряде случаев проводить оценку экспрессии трансгенов, что имеет немаловажное значение. При микроинъекции трансгены наугад интегрируются в любую часть генома. Это означает, что они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться в тех частях хромосомы, которые недоступны для транскрипции. Тестирование экспрессии в культуре сделает возможным использование для пересадки ядер, а следовательно и для получения трансгенных животных только тех клеточных линий, в которых трансгены являются транскрипционно и трансляционно активными. Кроме того, в отличие от метода пронуклеарной инъекции исследование ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного хххххххххх

Сенсационное сообщение было опубликовано в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована возможность получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Позже сообщили о получениитрансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных фибробластов (Schnieke et al., 1997). Из шести полученных трансгенных ягнят пять оказалось жизнеспособными. Степень трансгенности при использовании данной, метода составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Для получения одного трансгенного ягненка методом пересадки ядер требовалось 20,8 овец, в то время как при использовании метода пронуклеарной инъекции - 51,4 овцы [Schnieke et at., 1997]. Как и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций в желаемые участки генома. Кроме того, используемые клеточные линии могут быть кариотипизированы в культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. После получения трансгенных животных из различных клеточных линий и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных клонов для их дальнейшего использования в пересадках ядер.

Схема получения трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.

1.4 Липосомы как переносчики ДНК

Векторами для переноса генных конструкций в эмбриональные линии млекопитающих могут служить липосомы [Rottmann et al, 1985], однако опосредованный ими перенос генов не получили широкого распространения

1.5 Использование половых клеток семенников (спермии и сперматогонии)

Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается как один из перспективных методов генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.

Многочисленные попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством сперматазоидов в одной и той же лаборатории дае пра использовании одинаковой схемы исследований могут быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов.

Huguet и Esponda [1998] исследовали способность сперматозоидов поглощать линейную ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды инкубировали 2 часа с линейной ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную область семенных канальцев, после чего через 6 часов извлекали сперматозоиды. Присутствие чужеродной ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных канальцев не блокируют этот процесс.

Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al.. 1991], инъекцию в семенники [Sato et al.. 1994], непосредственную инъекцию в семенные канальцы [Kim et al.. 1997] и придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в семенные канальцы с последующей электропорацией [Yamazaki et al.. 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.

Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.

После пересадки половых клеток из семенников самца мыши в семенники другого самца, до 80% потомства происходило из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность успешного протекания сперматогенеза после пересадки криоконсервированных клеток семенника и после их длительного консервирования.пересадке в семенники мышей клеток из семенников поздних стадий сперматогенеза половых клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].

Успешное длительное культивирование половых клеток животных in uru делает возможным проведение трансформации сперматогониев экзогенной ДНК с последующей селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo посредством ретровирусной системы доставки. Экспрессия ретровирусной генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали трансген.

В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для получения трансгенного потомства.

Не смотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а так же отдельные успешные попытки получения трансгенных свиней и КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных технологий.

Год	Событие	Автор
1971	Доставка чужеродной ДНК в ооциты кролика сперматозоидами	Bracket
1974	Получение трансгенных мышей с помощью вирусных векторов	Jaenish, Mintz
1976	Передача трансгена по наследству	Jaenish
1980	Получение трансгенных мышей микроинъекцией	Gordon
1981	Получение стволовых клеток	Ewans, Kaufman, Martin
1984	Эмбриональные химеры из клеток тератокарциномы	Bradley
1985	Получение трансгенных сельскохозяйственных животных	Brem, Hammer
1986	Эмбриональные химеры с использованием ЭСК Получение овец посредством пересадки ядер	Gossler, « 1 2 3 4 » К-во Просмотров: 682 Бесплатно скачать Реферат: Получение трансгенных животных >>> Скачать <<< Меню Поиск