Реферат: Получение трансгенных животных
Для того чтобы преодолеть позиционный эффект и таким образом увеличить вероятность оптимальной экспрессии трансгенов, интегированных в случайной локализации, был применен целый ряд различных стратегий.
Первым таким подходом, позволившим увеличить уровень экспрессии, являлось введение в генные конструкции гомологичных интронных последовательностей.
Положительное влияние на уровень экспрессии трансгенов оказывало введение в генные конструкции S/MAR-элементов
Наиболее удачным решением проблемы преодоления позиционного эффекта явилось интеграция в определенный участок генома посредством гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках, так как это обеспечивает контроль трансгенной конструкции всеми регуляторными последовательностями, присутствующими в выбранном эндогенном локусе. Оптимальная локализация трансгенов в геноме клетки хозяина может быть выбрана исходя из уровня и характера экспрессии экспериментального трансгена. Еще одним подходом, позволившим дайной интеграции трансгена в геном хозяина является включение в генные конструкции всех регуляторных элементов, ответственных за его экспрессию. Стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не могут быть использованы, вследствие их ограниченной емкости. Данная стратегия может быть использована с применением векторов типа искусственных хромосом, обладающих повышенной клонирующей способностью.
Наиболее широкое применение для получения трансгенных животных нашли векторные системы на основе YAC (обзоры Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC- эукариотические клонирующие векторы, способные к стабильному сохранению геномных фрагментов ДНК длиной более 1 миллиона п.о. [Burke., 1987]. Они представляют собой линейные фрагменты ДНК, содержащие все необходимые элементы для их сохранения в клетках дрожжей в виде искусственных хромосом. Первые результаты успешного использования YACs в экспериментах по трансгенезу на мышах были получены в 1993 году [Jakobovits et a/., 1993, Schedl et a/., 1993, Strauss etal., 1993].
Для введения YACs в эмбрионы мышей нашли применение три различных подхода: пронуклеарная микроинъекция очищенной в геле YAC-ДНК [Schedl et a/., 1993], липофекция YAC-ДНК в эмбриональные стволовые клетки [Strauss et a/., 1993] и слияние дрожжевого сферобласта с эмбриональными стволовыми клетками [AtoboWte ef a/., 1993). Исследование экспрессии YACs у различных линий трансгенных мышей выявило зависимость уровня экспрессии от числа копии трансгена. С другой стороны, уровень экспрессии не зависел от позиционного эффекта
В то время, как YAC-технологии широко испо