Реферат: Порушення обміну оксиду азоту при вазотоксичній дії свинцю та пошук нових засобів біологічної профілактики

Ацетат свинцю на фіз. р-ні

1,53 мг/кг в/о

9.

Ацетат свинцю на фіз. р-ні +

глутаргін

1,53 мг/кг в/о

100 мг/кг з їжею

10.

Ацетат свинцю на фіз. р-ні +

водний р-н екстракту S. coronata

1,53 мг/кг в/о

20 мг/кг з їжею

Примітка: в/о – внутрішньоочеревинний шлях введення, фіз. р-н – фізіологічний розчин.

Після припинення експозиції половину тварин знеживлювали шляхом декапітації та проводили дослідження, а решту утримували в умовах віварію 1 місяць, після чого теж знеживлювали. Після декапітації забирали кров та одразу видаляли внутрішні органи.

Концентрацію свинцю у біологічних середовищах щурів визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії в полум’ї.

Дослідження кількості еритроцитів та гемоглобіну проводили фотоколориметричним методом, розрахунок лейкоцитарної формули, кількості ретикулоцитів, еритроцитів з базофільною зернистістю здійснювали по загальноприйнятій методиці. Визначення стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу проводили кінетичним методом.

Біохімічні дослідження, що характеризують стан окисного метаболізму та обмін оксиду азоту, проводили у плазмі, еритроцитарному концентраті, гомогенатах тканин печінки і аорти.

Рівень загальних вмісту тіолових сполук в гомогенаті печінки оцінювали з реактивом Елмана (Ellman G.I., 1959), рівень небілкових (низькомолекулярних) тіолів визначали після осадження трихлороцтовою кислотою. Вміст пероксиду водню (Н₂ О₂ ) визначали спектрофотометрично після додавання аліквоти проб до розчину йодиду калію (0,1 моль) із надлишком лактопероксидази (50 нмоль) у фосфатному буфері (0,05 моль) при довжині хвилі 353 нм (Huwiler M., 1984). Рівень генерації супероксид-аніону у пробах оцінювали по зміні екстинції при 550 нм за окисленням цитохрому С у 10 ммоль тріс-буфері після інкубації сумішей при 37 °С протягом 30 хв (Mc. Cord J., 1982). Визначення рівнів генерації ОН-радикалу проводили в інкубаційній суміші по приросту малонового діальдегіду (Conte D., 1996).

Активність сумарної NOS визначали за вмістом новоутвореного нітрит-аніону колориметричним методом (Vodovotz Y., 1994; Green L.C., 1982). Інкубаційна суміш складалась з 50 ммоль фосфатного буфера (рН 7,4), 1,25 ммоль CaCl₂ , 1 ммоль NADPH, 1 ммоль L-аргініну. Для визначення іNOS в інкубаційну суміш замість CaCl₂ додавали 0,1 ммоль ЕДТА. Розрахунок активності сNOS проводили шляхом віднімання від показника активності сумарної NOS показник активності іNOS. Вміст нітрит-аніону (NO₂ ^-‾ ) визначали в безбілкових аліквотах гомогенатів чи надосадових проб після визначення активності NO-синтази у колориметричній реакції за допомогою реактиву Гріса методом Гріна (Green L.C., 1982). Вміст нітрат-аніону (NO₃ ^‾ ) визначали спектрофотометричним методом (Isukahara H., 1996) у модифікації з бруцином. Концентрацію низькомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ) визначали в безбілковій кислоторозчинній фракції за методикою визначення NO₂ ^- з модифікованим реактивом Гріса, що містив катіони Нg²⁺ (2,5 % Hg²⁺ в 4 % розчині Н₃ РО₄ ) (Padgett C. M., 1998). Визначення високомолекулярних нітрозотіолів (ВМНТ) проводили за методикою визначення NO₂ ^- в білкових аліквотах після гідролізу проб протягом 18 годин при кімнатній температурі у присутності катіонів Нg²⁺ (Padgett C. M., 1998). Визначення нітратредуктазної активності проводили за змінами вмісту субстрату субстрату – нітрат-анону- в натрій-фосфатному (20 ммоль/л рН 7,4) в присутності надлишку NADH (Li H., 2001). Активність аргінази визначали спектрофотометричним методом за вмістом сечовини (Garganta C. L., 1982). Концентрацію сечовини оцінювали в безбілкових пробах колориметричним методом з набором реактивів фірми LAСHEMA. Вміст загального білку в пробах визначали загальновідомим методом Бредфорд.

Дослідження скоротливої функції аорти проводили на препаратах ізольованих сегментів грудного відділу аорти експериментальних тварин (щурів) (Соловйов А.І., 2000; Ткаченко М.М., 2002). Після видалення аорту нарізали на сегменти шириною близько 1,5 – 2 мм (маса близько 2 мг) під кутом 45° із урахуванням циркулярної орієнтації гладком’язевого шару. Препарат ізольованого сегменту аорти поміщали в проточну термостатовану (36° С) камеру в стандартний розчин Кребса (NaCl – 133,0; KCl – 4,7; NaHCO₃ – 16,3; NaH₂ PO₄ – 1,38; CaCl₂ – 2,5; MgCl₂ – 1,05; глюкоза – 7,8 ммоль/л; рН 7,4), де його піддавали розтягненню з силою 10 мН і витримували протягом 30-40 хв. Скорочувальну активність гладеньких м’язів (ГМ) аорти реєстрували за допомогою механоелектричного перетворювача 6МХ1С в режимі, що наближався до ізометричного. Активацію ГМ проводили додаванням до буферного розчину норадреналіну (НА, “Sigma”, США). Ендотелійзалежні та ендотелійнезалежні реакції досліджували по зміні тонічного напруження ГМ на ендотелійзалежний агоніст мускаринових рецепторів ацетилхолін гідрохлорид (“Flьka”, Швейцарія) та ендотелійнезалежний агоніст нітропрусид натрію (“Sigma”, США). Зміну амплітуди тонічного напруження вимірювали у відсотках відносно до їх сталого скорочення на НА (скорочення на НА приймали за 100%).

Обсяг проведених досліджень приведено у табл. 2. Результати обробляли методом варіаційної статистики, використовуючи програмне забезпечення Origin 6.0 фірми “Microcal Software, Inc” (США).

Таблиця 2. Обсяг проведених досліджень.

№	Метод дослідження	Кількість досліджень
1.	Визначення вмісту свинцю у біосередовищах	40
2.	« 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 » К-во Просмотров: 381 Бесплатно скачать Реферат: Порушення обміну оксиду азоту при вазотоксичній дії свинцю та пошук нових засобів біологічної профілактики >>> Скачать <<< Меню Поиск