Реферат: Структура и свойства мембранных липидов
Инфракрасная спектроскопия
Этот метод также основан на регистрации колебательных спектров молекул, но до недавнего времени его применение для изучения биологических объектов было ограниченным из-за невозможности работы с водными суспензиями. После разработки современных ИК-спектрометров с фурье-преобразованием многие из этих проблем были решены. В настоящее время опубликовано немало работ по изучению липидных дисперсий и биологических мембран методом фурье-ИК-спектроскопии. Преимущества этого метода перед спектроскопией КР состоят в его значительно более высокой чувствительности, а также в том, что флуоресцирующие примеси или хромофоры не мешают измерениям. Как и в случае спектроскопии КР, фурье-ИК-спектры чувствительны к изменениям полиморф-ио-фазового состояния липидов. Поэтому фурье-ИК-спектроскопия использовалась для изучения предпереходов в фосфатидилхолино-вых бислоях, главного фазового перехода гель—жидкий кристалл, а также перехода яичного фосфатидилэтаноламина из ламеллярной фазы в гексагональную Нц-фазу.
Изменение коиформации липидных цепей сопровождается частотным сдвигом полос поглощения групп СНг, причем эти изменения коррелируют с изменением доли гош-коиформеров в цепях. Например, в присутствии холестерола число гош-коиформеров в ди-пальмитоилфосфатидилхолине при температурах выше температуры главного фазового перехода снижается, что согласуется с изменениями упорядоченности бислоя, измеренной методом 2 Н-ЯМР. Встраивание в бислой интегрального мембранного белка оказывает совершенно иной эффект: число гош-кон-формеров в жидкокристаллической фазе практически не изменяется, но увеличивается их содержание в фазе геля, поскольку белки мешают ацильным цепям упаковываться в полностью-транс-конфигура-ции.
Более детальную картину строения гидрофобной области липидного бислоя удалось получить с помощью метода 2 Н-ЯМР. Атомы водорода в определенных местах липидной молекулы можно избирательно заменить дейтерием. Это сравнительно мяг-
кий способ зондирования мембран, и считается, что он, как правило, не вносит возмущений в их структуру. Спектры некоторых дейтерированных димиристоилфосфатидилхолинов представлены на рис. Расстояние между двумя пиками Avq, называемое квадрупольным расщеплением, зависит от усредненной по времени ориентации вектора С—D-связи по отношению к нормали к бислою. Усредненную по времени ориентацию можно выразить через параметр упорядоченности следующим образом:
где <cos2 0) отражает усреднение ориентации по времени, aScdявляется параметром упорядоченности связи. Необходимо подчеркнуть, что результат измерения является величиной, усредненной по всем молекулам.
При хаотичной ориентации. Этот параметр описывает усредненную ориентацию данного сегмента ацильной цепи:
мол = _ 2Scd-
Параметр упорядоченности, получаемый с помощью метода 2 Н-ЯМР, отражает усредненную ориентацию и мало что говорит о динамике системы и о характере движений.
Особое значение имеет тот факт, что локальное магнитное поле, в котором находится конкретный атом дейтерия, зависит от ориентации С—D-связи по отношению к внешнему магнитному полю. Колебательные и вращательные движения молекулы, которые влияют на ориентацию С—D-связи в бислое в целом, происходят с достаточно большой скоростью, так что любой атом дейтерия воспринимает единое усредненное магнитное окружение. Это окружение зависит от соседних атомов, а также от ограничений движения по типу и амплитуде. В этом отношении метод 2 Н-ЯМР отличается от КР- и ИК-спектроскопии, поскольку переходы транс-и гош- совершаются с гораздо меньшей частотой, чем разность частот колебательных полос, отвечающих этим формам. Поэтому ИК- и КР-спектры дают картину, которую можно назвать моментальной фотографией вклада транс- и гош-ротамеров в спектральные параметры. Для измерения параметров упорядоченности применяют и другие методы, в частности спектроскопию ЭПР и флуоресенцентную спектроскопию.
На рис. приведены параметры упорядоченности, определенные по данным 2 Н-ЯМР для нескольких селективно дейтерирован-ных фосфолипидов, в которых атом дейтерия включен в определенные метиленовые группы sn-1-пальмитоильного остатка. Исследовались как липидные бислои, так и природные мембраны, находящиеся в жидкокристаллическом состоянии, поскольку в случае фазы геля спектры очень уширяются из-за плотной упаковки липидов и потому с трудом поддаются анализу. Эти данные позволяют сделать два вывода.
1.Параметр упорядоченности довольно постоянен на участке от С-2 и до примерно С-8 или С-10. Метиленовые группы в средней части бислоя значительно более разупорядочены, чем группы вблизи его поверхности.
2.Для синтетических липидов разных типов, включая фосфати-дилхолин, фосфатидилсерин и сфингомиелин, а также для биологических мембран, содержащих дейтерированные зонды, получен одинаковый профиль параметра упорядоченности. Таким образом, характер упорядоченности бислоя мало зависит от химического строения липида и от состава мембраны, если бислой находится в жидкокристаллическом состоянии.
Количественный анализ этих данных можно провести на основе молекулярного моделирования с использованием методов статистической механики. Например, приведенные результаты согласуются с наличием в каждой цепи дипаль-митоилфосфатидилхолина четырех или пяти гош-ротамеров при очень малом содержании кинков. Поскольку каждая цепь закреплена у поверхности бислоя, участок цепи вблизи поверхности наиболее упорядочен. Обратите внимание, что бислой — это высококооперативная система. Ацильная цепь не может изменить свое направление без компенсационных изменений соседних цепей. Поэтому группа смежных сегментов цепи должна двигаться кооперативно. Отклонения ориентации сегментов цепи от нормали к бислою будут усиливаться по мере перехода от поверхности бислоя к его центральной области. Поэтому разупорядочен-ность максимальна в середине бислоя, где подвижность цепей такая же, как в жидком парафине. Данные других методов также показывают, что молекулярная подвижность максимальна в центре бислоя. Но необходимо отметить, что неупорядоченность — это статистический параметр, который ничего не говорит о характере движения. Так, можно иметь сильно неупорядоченную структуру, которая в то же время обладает малой подвижностью.
Дифракция нейтронов
Селективно дейтерированные фосфолипиды можно также исследовать методом дифракции нейтронов. Если рентгеновские лучи рассеиваются на электронах, то нейтроны — на ядрах атомов. Рассеивающие свойства 'Н и 2 Н сильно различаются, что позволяет выявлять дейтерированные области по кривой плотности рассеяния. Например, судя по данным дифракции нейтронов, атом С-5 находится на расстоянии 15 А от центра дипальмитоилфосфатидил-холинового бислоя в фазе геля; это соответствует полностью вытянутой транс-конфигурации цепей. Используя D2Oв качестве растворителя, можно определить локализацию воды в фазе геля; полученные данные показывают, что вода проникает до области локализации глицерольных остатков. С помощью рассеяния нейтронов можно определить также локализацию ионов, таких, как Са2+ .