Реферат: Вплив кріоконсервованих фетальних нервових клітин на репаративні процеси в патологічно зміненій сітківці

У роботі були використані 88 статевозрілих кролів породи Шиншила масою 1,5-2,5 кг, які утримувались в стандартних умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти при нормальному освітленні і годівлі ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (29.09.01.), що узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Для вивчення впливу застосування КФНК на репаративно-регенеративні процеси в сітківці була обрана модель лазерного опіку сітківки (Ченцова Е.В. та співавт., 2005). Лазерне ушкодження сітківки здійснювали за допомогою аргонової лазерної установки Visulas-532 (CARLZAISS, Німечіна). На нижню половину очного дна кожного експериментального ока через грань 3-дзеркальної лінзи наносили по 10-15 коагулятів. Ушкодженню піддавали праві очі, а контроль здійснювали на лівих очах тварин. Середня потужність випромінювання 400мВт, тривалість експозиції 0,1 сек., діаметр плями 100 мкм. За класифікацією L'еsреrаnсе світловий опік відповідав III ступеню (Ченцова Е.В., Пак Н.В., Иванов А.Н., Сухих Г.Т., 2005).

Для досліджень використали імунобіологічний препарат «Cryocell», розроблений в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків (Грищенко В.І. та співавт., 2001). Сертифікат про державну реєстрацію імунобіологічного препарату «Cryocell» № 371/03-3002 00 000 від 29.05.2003 р. та № 604/06-300200000 від 04.07.2006 р.

Вивчали вплив нейротрофічних факторів на репаративні процеси в сітківці після лазерного опіку.

Неспецифічним ростовим фактором вважали рівень продукції TGF β-1, а специфічним ростовим фактором для нервової тканини – рівень продукції GNF.

Показники продукції нейротрофічних факторів у плазмі крові кролів досліджували на 3, 7, 14, 21-шу добу і у віддалений термін спостереження (один та шість місяців).

Нейротрофічні фактори визначали за допомогою тест – систем: SPECIALINFORMATION REGARDING BIOTRAK TGF β-1 (Transforming Growth Factor Beta-1) and GNF (Growth Neural Factor) human, ELISA System фірми Аmersham Pharmacia Biotech.

Експерименти проводили на 36 кролях, які розподілили на три групи: 1) перша – інтактна; 2) друга – основна; 3) третя – контрольна.

Інтактна група – кролям не виконували лазерного опіку сітківки. Основна група – внутрішньовенне і парабульбарне введення КФНК після лазерного опіку сітківки. Контрольна група – кролі з мимовільним загоєнням лазерного опіку та група кролів, яким лікування проводили за стандартною схемою: внутрішньовенне введення препаратів милдронату і тренталу, а також їх місцеве введення разом з емаксипіном.

Шлях і час міграції КФНК визначали за допомогою генетичної мітки методом ПЦР. Було використано 21 кроль.

Приготовували зразки клітин, які містять у геномі локус гена SRY, що визначає стать. Спочатку визначали в зразках методом ПЛР присутність локусу гена SRY, і клітини позитивні по Y-хромосомі далі використовували для введення лабораторним самкам кролів.

Клітини, що містять Y-хромосому, вводили кролям парабульбарно в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30×10⁶ ядерних клітин. Проводили забій кролів експериментальних груп через 6, 12, 24 години і на третю добу після застосування КФНК.

За наявністю специфічного фрагмента ампліфікації розміром 336 пар нуклеотидів судили про присутність фетальних клітин з Y-хромосомою в досліджуваних тканинах.

Для ідентифікації і визначення шляхів міграції КФНК після введення використовували метод суправітального фарбування при використанні флюоресцентного зонда DDC, розробленого в НТК „Інститут Монокристалів НАН України (Егоров М.І., Дюбко Т.С., Ліннік Т.П. та співав., 2005; Боровой И.А., Малюкин Ю.В., Семиноженко В.П. , 2006).

У цьому експерименті було використано 15 кролів, по три кроля у кажному періоді спостереження. Перед введенням КФНК проводили суправітальне фарбування клітин розчином барвника DDC і вводили клітини кролям парабульбарно з лазерним опіком в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30×10⁶ ядерних клітин. Забій кролів проводили через 24 години, на 3-, 7-, 14- та 21-шу добу.

Було проведено патоморфологічне дослідження сітківки після ушкодження протягом періоду відновлення у двох експериментальних груп (16 кролів). Попередньо усім тваринам зроблено опік сітчастої оболонки правого ока. Дослідження гістологічних препаратів проводили на 1-, 3-, 7- і 14-ту доби.

Гістологічні препарати виготовляли з парафінових зрізів і фарбували гематоксилін-еозином. Вивчали препарати за допомогою світлової мікроскопії при довжині хвилі 380 нм., на мікроскопі PZO № 21940 (Німечіна) з об'єктивом 20, при окулярі ×15.

Клінічні спостереження. Ми спостерігали за 37 пацієнтами з дистрофічною патологією органа зору (60 очей), внаслідок сухої форми ЦХРД.

Хворі були розподілені на дві групи: контрольна група – 18 пацієнтів (29 очей), у яких лікування проводилось традиційним методом, основна група – 19 пацієнтів (31 око), лікування проводилось з застосуванням КФНК на фоні стандартної терапії.

Усім пацієнтам проводили повне офтальмологічне обстеження: візометрія, периметрія з визначенням сумарного поля зору і центральних скотом, офтальмоскопія очного дна, электроокулографія і ретинальна томографія, які повторювали через 10 діб, один, три і шість місяців.

Для більш детального огляду центральних і периферичних відділів очного дна застосовували налобний офтальмоскоп „Скепенс” його вітчизняний аналог НВО-2 з набором асферичних лінз, ретинальний томограф HRT-II. Для аналізу стану макули використовували програму HRT-II Macula Edema Software (конфокальна лазерна скануюча система для зйомки та аналізу трьохмірних зображень заднього сегмента ока).

Гостроту зору з корекцією та без неї визначали за таблицями Головіна-Сивцева на апараті Рота, сумарне поле зору і площу центральних скотом – на проекційно-реєстраційному периметрі ПРП – 60.

Границі поля зору на біле світло діаметром 3 мм визначали при постійній швидкості пересування об'єкта 1-2 см/сек, у восьми меридіанах із інтервалом 45°.

Окулографію проводили методикою G.B. Arden (1962) при використанні спеціальної камери для обстеження хворого в незатемненій кімнаті. Електроокулографія дозволяє дослідити й оцінити функціональний стан пігментного епітелію і свідчить про рівень кровообігу в хоріокапілярному шарі.

Результати вимірів усіх досліджених показників статистично обробляли за методом Стьюдента, за допомогою критерію Стьюдента визначали рівень вірогідності середнього значення (р<0,95; >0,95; >0,99; >0,999).

Обстежені групи хворих після лікування різними способами представляли у виді дисперсійних комплексів, за допомогою двохфакторного дисперсійного аналізу визначали ступінь впливу різних факторів на результати дослідження.

За допомогою кореляційного аналізу була встановлена наявність і сила зв'язку між парами досліджених показників у процесі лікування і відновного періоду, тобто ступінь зв'язку між рядами регресії, що відбивають динаміку досліджених показників.

Статистичну обробку результатів досліджень робили з використанням комп'ютерних програм “STATGRAPHICS Plus” і “Microsoft Office Excel”.

Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПК і К НАН України.

Результати досліджень та їх обговорення