Реферат: Взаимодействия белков с РНК – структурный компьютерный анализ

Первоначальный набор фаз получен с помощью метода молекулярного замещения. Основой для модели послужила структура с заменой Met на SeMet комплекса S15(I11M+A79M)-16SрРНК.

Для решения задачи молекулярного замещения использовалась процедура оптимизации ориентации и положения модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов. Расчеты проводились с помощью программы комплекса CNS RIGIT-BODY REFINEMENT. Полученный R-фактор (0,339), показал, что при общей гомологии комплексов (»99%) всё же наблюдается расхождение в боковых цепях и петлях.

2.1.4. Построение и уточнение модели

Первоначально были проведены несколько циклов автоматического (программой CNS) кристаллографического уточнения, которое включало в себя молекулярно-динамическую процедуру моделированного отжига (ANNELING), проводимую во внутренних координатах; уточняемыми параметрами были торсионные углы. При этом использовались ограничения (типа “restraints”) в соответствии с операцией некристаллографической симметрии.

Затем были получены две карты электронной плотности:

карта, рассчитанная с использованием коэффициентов 2fo-fc, где fo – структурный фактор, полученный экспериментально на основе дифракционных данных, fc – структурный фактор, рассчитанный на основе модели

composit-omit map – разностная 2fo-fc карта, где fc определяется как комбинированная величина, рассчитанная по нескольким моделям с исключением 5% атомов на каждом шаге.

Полученные карты были хорошего качества, что позволило вписать все боковые остатки белка, уточнить положение главной цепи и молекулы РНК. Для ручной правки использовалась программа молекулярной графики О.

Окончательное уточнение включало уточнение параметров длин связей и углов с помощью программы MINIMIZE (CNS), уточнение В-факторов для индивидуальных атомов, а так же проверку стереохимии полученной структуры и расстояний между атомами (водородные связи, Ван-дер-Вальсовы взаимодействия, «плохие» расстояния).

Окончательная модель, уточненная до значений R-фактора ***8% и Rfree ***% при разрешении до 2,8Е, включает ** аминокислотных остатков и ** нуклеотидов. Кроме того были локализованы *** молекул воды, ** ионов ионов Mg+2 в независимой части элементарной ячейки. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило ****. Модель обладает хорошими стехиометрическими параметрами и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана. Часть окончательной 2Fo-Fc карты электронной плотности на уровне 1.5 s показана на рис. 20. Структура комплекса S15-16SрРНК схематически показана на рис. 21. Координаты атомов окончательной модели комплекса S15-16SрРНК занесены в RCSB Protein Data Bank (код ****).

2.2. Результаты и их обсуждение

В результате проделанной работы была построена модель структуры комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).

Модель была уточнена до R-фактора 24,5% и Rfree 30,9% при разрешении до 2,9Е, и включает 86 аминокислотных остатков и 57 нуклеотидов. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило 1943. Модель обладает хорошими стехиометрическими параметрами и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана.

Таблица 2.2.1. Статистика уточнения структуры комплекса комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)

Пространственная группа	Р6422
Параметры ячейки (Е)	a=128.228, b= 128.2286, c=64.9505
Длина волны (Е)	0,933
Разрешение (Е)	500 - 2,9
Избыточность	5,9
Полнота набора (%)	98,0
Rsym (%)	3,1
Rcryst/Rfree (%)	24,5/30,9
Разрешение (Е)	6,0 – 2,9
Число рефлексов	8209
Вср (Е)	44,8
R.m.s.d. связей (Е)	0,006
R.m.s.d. углов (°)	1,2

Как видно из рисунка 2.2.1., белок S15 относится к семейству a-спиральных белков и состоит из четырёх a-спиралей, взаимодействующих с 16SрРНК и стабилизирующих данную структуру.

Фрагмент 16S рРНК из T.thermophilus (рис. 2.2.2.) длиной 57 нт состоит из укороченных спиралей Н20, Н21 и Н22. Спираль Н22 стыкуется со спиралью Н21, образуя вытянутую структуру, а спираль Н20 прилегает к ней под углом примерно в 60°.

ри