Биология / Статья: Исследование процесса физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде

Статья: Исследование процесса физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде

В настоящее время во всем мире растет интерес к получению природных соединений, меченных стабильными изотопами (² Н, ¹³ С, ¹⁵ N, ¹⁸ O и другие), которые необходимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения процессов метаболизма клетки [1-5]. Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ЯМР [6, 7], инфракрасной [8, 9] и лазерной спектроскопией [10], масс-спектрометрией [11]. Это позволило за последние годы повысить эффективность проведения многочисленных биологических исследований de novo , а также изучать структуру и механизм действия биологически активных соединений (БАС) на молекулярном уровне. Большое значение в этом аспекте имеют природные соединения, содержащие дейтериевую метку, которые удобнее всего получать с использованием микроорганизмов. Именно поэтому разработка путей препаративного получения дейтериймеченых БАС является актуальной задачей для современной биотехнологии. Стоимость биотехнологически полученных изотопномеченых соединений водорода значительно ниже, чем химически синтезированных, что представляет интерес для поиска новых штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к высоким концентрациям дейтерия в ростовых средах и для дальнейшего изучения их свойств.

С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать полученные в результате мутагенеза или генной инженерии штаммы-продуценты для направленного синтеза дейтериймеченых соединений [12, 13]. Традиционным подходом при этом остаётся культивирование бактерий на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды или других дейтерированных субстратов, например, [U- ² Н]метанола [14-17]. Однако подобные процессы редко применяются в биотехнологии, вследствие наличия ряда трудностей, связанных с адаптацией и культивированием микроорганизмов на средах с максимальными концентрациями ² H₂ О. Поэтому целый ряд вопросов, которые касаются принципиальной возможности использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза на высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными.

Важной проблемой, требующей скорейшего разрешения, является изучение процессов физиологической адаптации клетки к ² H₂ О. Известно, что высокие концентрации ² H₂ О в ростовой среде могут вызвать ингибирование жизненно-важных функций роста и развития многих микроорганизмов [18]. Несмотря на негативный биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клетки, некоторые бактерии устойчивы к высоким концентрациям тяжёлой воды в среде [19], в то время как растительные клетки могут нормально развиваться при концентрациях не более 50-75% ² H₂ О [20], а клетки животных не более 35% ² H₂ О [21]. Явление адаптации к ² H₂ О интересно не только само по себе, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Эти данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium methylicum , облигатные метилотрофные бактерии Methylobacillus flagellatum , галофильные бактерии Halobacterium methylicum и бациллы Bacillus subtilis .

Целью настоящей работы было исследование процесса физиологической адаптации этих продуцентов БАС при росте на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды. Поскольку биосинтетический потенциал используемых штаммов при росте на тяжелой воде к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование их способности к синтезу целевых продуктов в условиях максимально дейтерированных сред. Исследования по адаптации к ² H₂ O метилотрофных бактерий B. methylicum заложили основу для использования компонентов их (² Н)меченой биомассы, полученной в ходе многоступенчатой адаптации к ² H₂ O в качестве ростовых факторов для культивирования других микробных продуцентов БАС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцентфенилаланина.

2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцентлейцина.

3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу штамм грамотрицательных бактерий, продуцент инозина.

4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

Для приготовления питательных сред и адаптации бактерий использовали ² H₂ O (99.9% ² H), и ² HСl (95.5% ² H) и [U- ² Н]метанол (97.5% ² H), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости ² H₂ O очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [22].

Стартовым материалом для культивирования галофильных бактерий и бацилл служила (² Н)меченая биомасса метилотрофных бактерий, полученная в условиях многостадийной адаптации на твердых агаризованных средах (2% агар) с 2% [U- ² Н]метанолом, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% ² Н₂ О). Полученную таким образом (² Н)меченую биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0.5 н. растворе ² HСl (в ² H₂ O) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали далее в качестве источника ростовых факторов для адаптации и культивирования бацилл и галофильных бактерий.

В настоящей работе использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л):

1. Минимальная среда М9, на основе различных концентраций ² H₂ O (см. табл. 1 и табл. 2) и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической потребности бактерий) или [U-² H]метанола: KH₂ PO₄ 3; Na₂ HPO₄ 6; NaCl 0.5; NH₄ Cl 1. Среду использовали для культивирования метилотрофных бактерий.

2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на основе 100% ² H₂ О): глюкоза 120; (² Н)меченая биомасса B. methylicum 25; NH₄ NO₃ 30; MgSO₄ x 7H₂ O 20; мел 20.

3. Гидролизная среда 2 (ГС2)для культивирования галофильных бактерий (на основе 100% ² H₂ О): NaCl 250; MgSO₄ x 7H₂ O 20; KCl 2; CaCl₂ x 6H₂ O 0.065; цитрат натрия 0.5; (² Н)меченая биомасса B. methylicum 20.

Культивирование метилотрофных бактерий и бацилл проводили при 37⁰ С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методикам [14] и [15], используя в качестве источников дейтерия ² H₂ O и [U-² H]метанол. В случае с галофильными бактериями их культивирование проводили на ² H₂ O-среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральных жидкостях анализировали секретируемые аминокислоты и нуклеозиды.

Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Липиды и пигменты экстрагировали смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [23]. Полученный осадок высушивали до постоянного веса (10-12 мг) и использовали его в качестве фракции суммарных белков биомассы.

Суммарные белки биомассы гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти кратном избытке 6 н. ² HCl (в ² H₂ O). Ампулы выдерживали при 110⁰ в течение 24 ч. После этого реакционную массу суспендировали в горячей дистиллированной воде, фильтровали. Гидролизат упаривали в роторном испарителе при 40⁰ С. Остатки дейтеросоляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH.

Для проведения гидролиза внутриклеточных полисахаридов 50 мг сухой делипидизованной биомассы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл дистиллированной воды и 1.6 мл 25% ² H₂ SO₄ и кипятили с обратным водяным холодильником в течении 90 мин. По охлаждении реакционную смесь суспендировали в одном объёме горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. раствором Ba(ОН)₂ до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 40⁰ С.

Рост бактерий оценивали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, а также по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) или на пластинках с закреплённым слоем селикагеля фирмы Merck (Германия) в системах растворителей: изопропанол-аммиак, (7:3) (A) для аминокислот и н-бутанол-уксусная кислота-вода, (2:1:1), (Б) для инозина.

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом [24].

Секретируемые фенилаланин и инозин определяли на приборе Beckman DU-6 (США). Фенилаланин определяли при 540 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином, инозин - при 249 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 20 мкл.

Аминокислотный анализ гидролизатов суммарных белков биомассы проводили на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 x3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрийцитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм и 440 нм (для пролина).

Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH₂ , 10 мкм; 10 x250 мм; подвижная фаза: ацетонитрил-вода, (75:25); скорость подачи: 0.6 мл/мин.

Липиды анализировали на хроматографе Beckman Gold System (США), снабжённым насосом Model 166 (США) и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH₂ PO₄ -ацетонитрил; 100% в течении 50 мин; скорость подачи: 0.5 мл/мин; детекция при 210 нм.

Уровни включения дейтерия в аминокислоты белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum .

Для проведения адаптации к тяжёлой воде были использованы представители двух различных таксономических групп метилотрофных бактерий, взятых из коллекции ГОСНИИ Генетики: лейцинпродуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий Methylobacilus flagellatum , ассимилирующий метанол по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазному варианту рибулозо-5-монофосфатного (РМФ) цикла фиксации углерода [25] и фенилаланинпродуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum , ассимилирующий метанол по РМФ-циклу фиксации углерода [26]. Для культивирования и адаптации данных штаммов метилотрофных бактерий использовали минимальные среды М9, содержащие в качестве источников дейтерия ² H₂ O и [U-² H]метанол. В зависимости от физиологической потребности того или иного штамма бактерий в углеродном субстрате использовали 0.5-2% концентрации метанола в ростовых средах. Для компенсации ауксотрофности по лейцину и изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде в концентрациях 10 мг/л. В обычных условиях культивирования на протонированных средах уровни накопленияфенилаланина и лейцина в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов достигали величины 0.8 и 1.0 г/л соответственно.

Табл. 1

Влияние изотопного состава среды на рост штамма M. flagellaum