Статья: Определение интегральной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов
Антиоксидантное действие большинства биологически активных соединений связано с их способностью легко окисляться, отдавая электрон или атом водорода, что положено в основу определения индивидуальных восстановителей по их воздействию на окислительно-восстановительную систему, содержащую комплексные соединения ионов переходных металлов: Fe(III) – 2, 2′ дипиридил, Fe(III) – трипиридил-триазин, Fe(III) – ферроцин, Cu(II) – неокупроин, Ru – 2, 2′ дипиридил.
Введение в окислительно-восстановительную систему Fe(III)/Fe(II) органического лиганда – о-фенантролина увеличивает величину стандартного редокс-потенциала полуреакции [Fe(Phen)3]+3 + ē D [Fe(Phen)3]+2 до E° = 1,10 В, расширяя круг определяемых веществ. Следует также отметить, что способность органического лиганда образовывать с восстановленной формой железа устойчивый в широком диапазоне рН (2 – 9) окрашенный хелат со значительным молярным коэффициентом поглощения (ε = 11100) создает условия для высокочувствительного и селективного определения. Это позволяет использовать систему Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин для определения антиоксидантной способности биологически активных соединений.
Окислительно-восстановительная способность выбранной индикаторной системы и чувствительность определения зависят от количества и соотношения Fe(III) и о-фенантролина, которые целесообразно вводить в реакцию совместно в виде комплексного реагента.
Оптимизацию состава реагента проводили методом многофакторного планирования эксперимента, который позволил выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности. Факторами выступали – концентрация Fe(III), о-фенантролина и объем реагента, вводимый в реакцию с восстановителем. В качестве восстановителя выбрана аскорбиновая кислота, ввиду ее высокого окислительно-восстановительного потенциала и возможного присутствия в предполагаемых объектах исследования. Границы варьирования уровней факторов определялись шириной диапазона линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации аскорбиновой кислоты (0,05 – 2,0 мкг/см3), с одной стороны, и достаточной чувствительностью и устойчивостью аналитического сигнала во времени, с другой.
Для каждого состава реагента, по уравнениям регрессии, была рассчитана величина аналитического сигнала при концентрации аскорбиновой кислоты 1,2 мкг/см3 и подобран объем, при котором значение аналитического сигнала максимально. Дальнейшие расчеты позволили заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) – 0,01 М о-фенантролина, при его объеме, вводимом в реакцию 1,0 см3 на 100 см3 раствора.
Для доказательства суммарного характера определяемой величины АОА рассматривалось влияние восстановителей органической природы и их суммы на индикаторную систему.
Изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей на систему Fe(III)–о-фенантролин оптимального состава. Для исследования выбраны широко распространенные в растительном сырье, материалах и используемые в пищевой промышленности антиоксиданты фенольной (галловая кислота, кверцетин, рутин, танин, гидрохинон) и нефенольной (аскорбиновая кислота, цистеин, глутатион) природы.
Аналитический сигнал для перечисленных органических соединений линейно зависит от концентрации вещества в широком диапазоне, но не стабилен во времени. Это приводит к увеличению зависимого коэффициента в уравнении регрессии при сохранении линейности в том же диапазоне (таблица 1). Величина тангенса угла наклона зависимости аналитического сигнала от концентрации восстановителя изменяется от 0,01 для глутатиона до 0,5 для галловой кислоты, что объясняется различной антиоксидантной способностью изучаемых восстановителей. По уменьшению антиоксидантной активности их можно расположить в следующей последовательности: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистеин > глутатион. Антиоксидантная активность обусловлена числом и расположением функциональных групп, способных легко отдавать атом водорода (–OH, –SH, –NH), наличием сопряженных двойных связей, а также пространственной структурой молекул. Так, кверцетин, который имеет две 3' и 4' гидроксильные группы в орто-положении кольца В и одну в 3 положении кольца С является более эффективным антиоксидантом, чем его гликозид рутин, активная 3 – OH группа которого замещена сахарным остатком (рутинозой). Кроме того, наличие гликозидного остатка приводит к изменению пространственного расположения молекулы, что также является причиной более низкой антиоксидантной способности гликозидов по сравнению с агликонами. Различие в восстановительной способности цистеина и трипептида глутатиона, по-видимому, также обусловлено пространственной структурой их молекул.
Таблица 1 – Зависимость аналитического сигнала от концентрации восстановителя во времени
| Восстановитель | τ, мин | Уравнения регрессии | R2 |
Диапазон линейности, мкг/см3 |
|
Аскорбиновая кислота | 30 | y = 0,2306x + 0,0037 | 0,9993 | 0,05 – 1,8 |
| 60 | y = 0,2465x + 0,0012 | 0,9996 | ||
| 90 | y = 0,2603x + 0,0013 | 0,9994 | ||
| 120 | y = 0,2713x – 0,0004 | 0,9991 | ||
| Танин | 30 | y = 0,1408x + 0,0028 | 0,9992 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1807x + 0,0009 | 0,9997 | ||
| 90 | y = 0,2118x + 0,0008 | 0,9991 | ||
| 120 | y = 0,2305x + 0,0039 | 0,9987 | ||
| Рутин | 30 | y = 0,1006x – 0,0011 | 0,9993 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1294x – 0,0016 | 0,9996 | ||
| 90 | y = 0,1535x – 0,0025 | 0,9997 | ||
| 120 | y = 0,1682x – 0,0024 | 0,9997 | ||
| Кверцетин | 30 | y = 0,3524x – 0,0018 | 0,9991 | 0,02 – 0,8 |
| 60 | y = 0,4390x – 0,0043 | 0,9987 | ||
| 90 | y = 0,4852x – 0,0046 | 0,9986 | ||
| 120 | y = 0,5156x – 0,0044 | 0,9983 | ||
|
Галловая кислота | 30 | y = 0,5201x – 0,0026 | 0,9995 | 0,02 – 0,8 |
| 60 | y = 0,5817x – 0,0003 | 0,9991 | ||
| 90 | y = 0,6304x – 0,0003 | 0,9989 | ||
| 120 | y = 0,6642x + 0,0003 | 0,9986 | ||
| Гидрохинон | 10 | y = 0,3481x + 0,0105 | 0,9993 | 0,05 – 1,4 |
| 20 | y = 0,3517x + 0,0078 | 0,9993 | ||
| 30 | y = 0,3522x + 0,0063 | 0,9994 | ||
| 60 | y = 0,3530x + 0,0061 | 0,9995 | ||
| 90 | y = 0,3541x + 0,0059 | 0,9994 | ||
| 120 | y = 0,3552x + 0,0051 | 0,9992 | ||
| Цистеин | 30 | y = 0,0847x – 0,0075 | 0,9967 | 0,1 – 2,0 |
| 60 | y = 0,1141x – 0,0051 | 0,9992 | ||
| 90 | y = 0,1301x – 0,0024 | 0,9997 | ||
| 120 | y = 0,1394x – 0,0001 | 0,9998 | ||
| Глутатион | 30 | y = 0,0107x – 0,0016 | 0,9880 | 1,0 – 20 |
| 60 | y = 0,0168x – 0,0022 | 0,9921 | ||
| 90 | y = 0,0212x – 0,0024 | 0,9959 | ||
| 120 | y = 0,0243x – 0,0022 | 0,9978 |
Реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу системы, антиоксидантные свойства которых реализуются за счет суммарного содержания и действия восстановителей различной природы. Как правило, в растительных природных объектах и пищевых продуктах одновременно содержатся фенольные соединения, витамины, моно- и полисахариды, органические и аминокислоты. Кроме того, при оценке антиоксидантной способности необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но и возможность их взаимного влияния (например, синергизм или антагонизм).
Для сравнения антиоксидантной активности различных восстановителей, их смесей и реальных объектов целесообразно выражать эту величину количеством вещества-стандарта, как принято при определении многих известных суммарных показателей. В качестве вещества-стандарта при определении АОА предложено использовать аскорбиновую кислоту (АК), поскольку установлено, что она по антиоксидантной способности занимает промежуточное положение среди изучаемых восстановителей.
Для подтверждения суммарного характера определяемой величины антиоксидантной активности изучено влияние модельных смесей, содержащих восстановители в различных соотношениях на индикаторную систему Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин. Расчет теоретической величины АОА, в пересчете на вещество-стандарт, проводили по уравнениям количественного соответствия, показывающим связь между количеством вещества-стандарта и восстановителя в условиях равной антиоксидантной активности. Экспериментальные значения АОА рассчитывали, подставляя величину аналитического сигнала модельной смеси в усредненное уравнение регрессии зависимости аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты. Результаты анализа модельных смесей представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, экспериментально полученные и теоретически рассчитанные величины АОА хорошо согласуются. Несколько завышенные результаты для моделей, содержащих аскорбиновую кислоту, вероятно, можно объяснить проявлением ею синергетических свойств. Полученные данные показывают, что определяемая величина – антиоксидантная активность – результат совместного действия всех присутствующих в модельной смеси восстановителей.
Таким образом, определяемый показатель является интегральным и индикаторная система Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин может быть использована при разработке способа оценки суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.
Таблица 2 – Результаты анализа модельных смесей (τ = 60 мин)
(n = 6, P = 0,95)
| Количество компонентов в смеси, мкг |
Теоретическое значение АОА, мкг АК |
Экспериментальное значение АОА, мкг АК | |||||||||
| введено | в пересчете на АК | ||||||||||
| АК | танин | рутин | кверцетин | цистеин | АК | танин | рутин | кверцетин | цистеин | ||
| − | 20 | 20 | 20 | − | − | 14,66 | 9,85 | 35,59 | − | 60,10 | 59 ± 5 |
| − | 10 | 10 | 10 | − | − | 7,33 | 4,92 | 17,79 | − | 30,04 | 27 ± 2 |
| − | 50 | 10 | 10 | − | − | 36,65 | 4,92 | 17,79 | − | 59,36 | 52 ± 5 |
| − | 10 | 50 | 10 | − | − | 7,33 | 24,63 | 17,79 | − | 49,75 | 51 ± 4 |
| − | 10 | 10 | 50 | − | − | 7,33 | 4,92 | 89,02 | − | 101,27 | 98 ± 8 |
| − | 30 | 10 | 10 | − | − | 21,99 | 4,92 | 17,79 | − | 44,70 | 38 ± 6 |
| − | 10 | 30 | 30 | − | − | 7,33 | 14,78 | 3,41 | − | 75,52 | 77 ± 9 |
| 20 | 20 | 20 | 20 | − | 20 | 14,66 | 9,85 | 35,59 | − | 80,10 | 97 ± 9 |
| 50 | 10 | 10 | 10 | − | 50 | 7,33 | 4,92 | 17,79 | − | 80,04 | 85 ± 10 |
| 10 | 50 | 10 | 10 | − | 10 | 36,65 | 4,92 | 17,79 | − | 69,36 | 74 ± 10 |
| 10 | 10 | 50 | 10 | − | 10 | 7,33 | 24,63 | 17,79 | − | 59,75 | 80 ± 11 |
| 10 | 10 | 10 | 50 | − | 10 | 7,33 | 4,92 | 89,02 | − | 111,27 | 129 ± 12 |
| 30 | 30 | 10 | 10 | − | 30 | 21,99 | 4,92 | 17,79 | − | 74,70 | 81 ± 8 |
| 10 | 10 | 30 | 30 | − | 10 | 7,33 | 14,78 | 53,41 | − | 85,52 | 108 ± 10 |
| 20 | − | − | 10 | 20 | − | − | − | 4,60 | 24,60 | 22 ± 2 | |
| 10 | − | − | 20 | 10 | − | − | − | 9,23 | 19,23 | 17 ± 2 | |
2 Разработка способа оценки антиоксидантной способности природных объектов
Проведенные нами исследования показали, что аналитические сигналы в индикаторной системе Fe(III)/Fe(II)−о-фенантролин меняются во времени в зависимости от концентрации как индивидуальных восстановителей и их смесей, так и реальных объектов. Это приводит к необходимости строгого контроля времени эксперимента, что делает его длительным, трудоемким, ухудшаются также метрологические характеристики анализа. Устранение этого недостатка и стабилизация аналитического сигнала требуют оптимизации условий протекания реакции. Для решения поставленной задачи рассматривались различные способы воздействия на реакцию, протекающую в системе: повышение температуры и введение в реакционную смесь реагентов, традиционно используемых для связывания ионов Fe+3 (фторида натрия, ЭДТА).