Учебное пособие: Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у жи

Чтобы закрепить все форменные элементы крови в препарате с максимально возможным сохранением их структуры и подготовить мазки к последующей окраске, существуют различные методы фиксации мазков. Наибольшее практическое значение имеют:

1. Фиксация абсолютным метиловым спиртом. Это лучший метод фиксации. Сухие мазки на 3 ми­нуты погружаются в абсолютный метиловый спирт или на то же время спирт наливается на мазок, вполне покрывая препарат. Через 3 минуты мазки вынимают (или сливают с них спирт) и просушивают на воздухе.

2. Фиксация абсолютным этиловым спиртом, смешанным с равным количеством эфира. Фиксация длится 10—30 минут в обычных сосудах для гистологических растворов. Этот способ значительно хуже, так как даёт много артефактов.

В. ОКРАСКА МАЗКА. ОСНОВНОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ПО РОМАНОВСКОМУ

Посредством окраски препарата наиболее отчетливо выявляется тончайшая структура, как ядра, так и цитоплазмы. Принцип современных методов окраски мазков крови открыт в 1891 г. Д. Л. Романовским и заключается в избирательном поглощении (химическом и коллоидальнохимическом) веществами клетки трёх красящих веществ — азура метиленовой синьки и эозина. Азур («красная из метиленовой синьки») имеет амфотерноосновную ре­акцию, метиленовая синька — щелочную, эозин — кислую.

Ядро клетки, богатое нуклеопротеидами и нуклеотидами, базофильно, т. е. окрашивается основными красками с избирательным поглощением а з у р а.

Цитоплазма молодых клеток, от­носительно богатая нуклеиновыми кислотами (нуклеотидами), также, хотя и в меньшей степени, базофильна. При этом избирательно погло­щается преимущественно метиленовая синь­ка. Цитоплазма же многих зрелых клеток крови (прежде всего нейтрофилов) ацидофильна (оксифильна).

Лимфоциты сохраняют базофилию цитоплазмы на всех стадиях развития, избирательно поглощая метиленовую синьку. Наличие базофилии молодой цитоплазмы, указывающее на относительное богатство её нуклеиновыми кислотами, связано с сохранением способности молодых клеток к интенсивному синтезу белков.

Лимфоциты сохраняют эту способность на весь онтогенез.

Базофилия гранул базофилов определяется наличием в них кислой слизи (мукоитиносерная кислота).

В лабораторной практике чаще всего пользуются следующими способами окраски по методу Романовского.

Окраска раствором Гимза

Краска Гимза, применяемая при окраске по ме­тоду Романовского, представляет собой комбинацию метилен-азура (азур II) и эозина (В, жёлтого). Она состоит из азура II*—3,0, эозина В —0,8, хими­чески чистого глицерина 250,0 и метилового спирта 250,0.

Эта краска обычно отпускается готовой. Очень многое в успехе окрашивания определяет безупреч­ное качество раствора краски, а последнее в высшей степени зависит от реакции воды.

Для приготовления рабочего раствора краски употребляется дважды дистиллированная вода. Обыч­но она имеет рН=5,4, т. е. слишком кисла, и даёт слабую, плохую окраску. Поэтому такую воду нуж­но подщелочить, прибавив к 2—3 л воды несколько капель 1-процентного раствора соды. Лучшим рН воды следует считать 6,8—6,9 (до 7,1). При более щелочной реакции воды мазки получаются более синими (даже эритроциты).

Практически пригодность воды к окрас­ке определяют по растворению в ней гематоксилина. В 10 см³ дистиллированной воды (лучше всего в часовом стёклышке) кладут пинцетом несколько крупинок гематоксили­на. Не ранее как через 1 минуту и не позже 5 минут вода должна окраситься в ясный слабофиолетовый цвет. Более раннее и интенсивное окрашивание ука­зывает на сильно щелочную реакцию, более позд­нее — на кислую.

Если нет очень хорошего гематоксилина, то реак­цию воды, подщелачиваемой раствором соды, можно определить, пользуясь в качестве индикатора ней­тральной красной. В два химических стакана (или кол­бы Эрленмейера) наливают по 200 см³ дистиллированной воды и прибавляют 1 — 2 капли 1-процентного раствора нейтральной красной. При рН дистиллированной воды, равном 5,4—5,5, получается свекловично-красная (рубиновая) окраска. После этого в один из стаканов прибавляют по капле, тщательно разме­шивая, 1% раствор соды до появления слабого оранжевого оттенка (цвет лососины). Нельзя доводить воду до ясно оранжевого и, тем более, жёл­того цвета, так как в этом случае реакция будет сильно щелочной.

Более кропотливо пользоваться индикаторами Михаэлиса и менее точно — универсальным индикатором.

Лучше всего для получения нужной и стойкой реакции воды применять буферные рас­творы. Хорошими буферными растворами для этой цели будут фосфатные. Для них нужно иметь два исходных раствора:

1. Двуосновного фосфата натрия (Na₂ HP0₄ . •2Н₂ 0)—17,814 г на 1 л (рН =8,302).

2. Одноосновного фосфата калия (КН₂ Р0₄ ) — 13,638 г на 1 л (рН =4,529).

Азур II — смесь в равных частях красок: азур I (диметилтиониохлорид) и метиленовой синьки. В постарев­шем растворе исходной краски Гимза метиленовая синька часто плохо окрашивает цитоплазму лимфоцитов (нет чисто голубого цвета). Тогда необходимо добавить метилено­вой синьки в исходный раствор краски.

Если к литру дистиллированной воды прибавить по 5 см³ того и другого раствора, то рН такой воды будет равен 6,813. Случайные колебания концентра­ции углекислоты в воздухе при таком способе не ока­зывают влияния на рН воды.

Перед окраской (ex tempore) к дистиллированной воде прибавляют исходный раствор краски Гимза из расчёта 1,0—1,5 капли краски на 1 см³ воды.

Рабочий раствор краски наливается пипеткой (ос­торожно!) на предметное стекло так, чтобы препарат (мазок крови) был полностью покрыт краской. Стёк­ла помещаются над широкой чашкой Петри на стек­лянных палочках, соединённых резиновыми трубками попарно. Во избежание осадков, которые невозможно отмыть, можно стёкла укладывать мазками вниз, на стеклянные палочки, лежащие в чашке Петри, так, чтобы краска покрывала мазки полностью (способ академика Н. Д. Стражеско).

При первом способе на один мазок тратится 2,5— 3,0 см³ рабочего раствора краски.

Через 20—30 минут краску сливают, препараты промывают водопроводной чистой водой и высуши­вают на воздухе. Для окраски старой краской тре­буется меньше времени.

При окраске раствором Гимза хорошо дифференцируется структура ядра, несколько хуже — структура цитоплазмы, особенно нейтрофильная зернистость. Однако при очень умелом окрашивании и зернис­тость выявляется достаточно хорошо.

По этому методу плохо окрашиваются псевдоэозинофилы (палочкозернистые гранулоциты) крови сель­скохозяйственных птиц.