Учебное пособие: Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у жи

а) Получение и окраска толстой капли. На хорошо промытое (подщелочённой водой, затем спиртом с эфиром) предметное стекло наносят 2 крупные капли крови. Собственно, достаточно одной капли, но вто­рая служит «резервом» на случай неосторожного сти­рания одной капли, неудачи окраски и т. д. Каждая капля сейчас же, с помощью иглы, распределяется по стеклу ровным слоем — примерно в 1\4 - 1\2 мм толщины, чтобы получились пятна размером с деся­тикопеечную монету. Препараты тщательно высуши­ваются (в термостате при 37° или на солнце) в течение получаса.

После этого высохший препарат дважды окраши­вают рабочим раствором Гимза (1 капля исходного спиртового раствора Гимза на 1 см³ дистиллирован­ной воды).

Первое окрашивание длится около 3 минут после того, как в растворе краски появится красное облачко растворившегося гемоглобина. Затем один конец предметного стекла слегка приподни­мают и старый раствор Гимза заменяют новым, при­ливая его очень осторожно с приподнятого конца препарата, в то время как прежний раствор краски с гемоглобином стекает с другого конца. Когда таким образом вся старая краска сменена новой, предмет­ное стекло снова устанавливают горизонтально и продолжают докрашивание ещё 25 минут.

Значение метода состоит в том, что в толстой капле удается обнаружить таких паразитов крови, которые находятся в ней в небольших количествах. Быстро устанавливается наличие или отсутствие эозинофилов и производится их подсчет их подсчёт.

То же самое в отношении базофильных эритроцитов.

б) Оксидазная и пероксидазиая реакции лейкоцитов. Оксидазная реакция основана на возникновении индофеноловой голубой краски при воздействии оки­сляющих ферментов на анафтол и диметилпарафенилендиамин; в местах локализации оксидаз в клетке возникает синее окрашивание.

Техника реакции состоит в следующем:

1. Фиксация мазка в смеси из 1 части 40-про­центного формальдегида и 9 частей 95-процентного спирта в продолжение нескольких секунд пли 40-процентного формальдегида и абсолютного алкоголя аа в продолжение 15—20 минут.

2. Окраска: а) 3 минуты слегка разведённым 1-процентным водным щелочным раствором анафтола (раствор приготовляется следующим образом: анафтол при нагревании в дестиллированной воде поднимается кверху и плавает в жидком виде; после введения в раствор кристалла едкой щёлочи анаф­тол растворяется в воде); б) не удаляя анафтола, на препарат наслаивают 1-процентный водный раствор диметилпарафенилендиамина. Через несколько ми­нут зернистость лейкоцитов, содержащая оксидазу, становится темносиней. Докрашивается препарат сильно разведённым раствором фуксина Циля.

Пероксидазная реакция.

а) Окраска по Край-биш в модификации Грэма. Хорошо высохший мазок в течение 10—15 минут фиксиро­вать жидкостью, состоящей из 1 части 40-процент­ного формалина и 9 частей 95-процентного спирта. После фиксации слегка промыть водой и покрыть раствором бензидина (приготовление: к 10 см³ 40-процентного этилового спирта прибавляется не­сколько кристаллов бензидина +00,2 см³ 3-процент­ной перекиси водорода). Окраска длится 5 минут. Затем смыть водой.

Места локализации пероксидаз окрашиваются сначала в сероватый, а затем в золотисто-коричне­вый цвет.

Последующее докрашивание — тионином, метиленовой синькой или краской Гимза.

б) Окраска по Сато. Воздушносухие маз­ки фиксируют в течение 30 секунд ¹ /₂ -процентным раствором медного купороса (CuS0₄ ) и затем окраши­вают бензидином с перекисью водорода (рецепт приготовления — как в предыдущем методе). Через 2 минуты препарат осторожно промывают дистил­лированной водой, на мазок наливают слой 1-процент­ного водного раствора сафранина, через 15—20 минут сафранин смывают водой и высушивают препарат на воздухе (избегать высушивания фильтровальной бу­магой!).

Пероксидазо-положительные гранулы окрашивают­ся в темносиний цвет, ядра — в красно-жёлтый; эритроциты не окрашиваются.

Посредством оксидазной и пероксидазной реакций облегчается диференциация миэлоидных клеток от лимфоидных. Обе реакции дают аналогичные резуль­таты, но оксидазная реакция более чувствительна.

Нейтрофилы и эозинофилы реагируют резко поло­жительно, базофилы так же, но только на ранних стадиях развития. Зрелые формы оксидазо-отрицательны. Однако ряд авторов считает, что и зрелые базофилы оксидазо-положительны.

Лимфоциты дают безусловно отрицательную реак­цию. Моноциты — иногда очень слабо положительную.

С клинической точки зрения представляет инте­рес тот факт, что при некоторых инфекционных забо­леваниях у нейтрофилов исчезают положительная оксидазная п пероксидазная реакции.

в) Окраска токсической зерни­стости раствором Гимза при рН =5,4. Токсическую зернистость, в отличие от обычной, нормальной зернистости гетерофилов (нейтрофилов), избирательно окрашивают, при окраске по принципу Романовского раствором краски Гимза, применяя буферный раствор с рН =5,4.

Буферный раствор:

Едкий натр (химически чистый) . 21,6 г

Уксусная кислота (химически чистая) .............. 27,0 »

Дистиллированная вода до.....1000,0 см³

Приготовление краски:

Исходной краски Гимза …………10см³

Дистиллигрованной воды ……….40 »

Буферного раствора до ………….100 »

Свежие мазки окрашивают в продолжение 1 часа, старые препараты — дольше (до 2 часов). Краска с мазка смывается буферным раствором и затем высу­шивается, как обычно.