Учебное пособие: Методы переноса генетического материала в клетки млекопитающих
Введение
Все эксперименты по переносу генетического материала состоят из двух отдельных этапов: переноса ДНК от донора к реципиенту и отбора реципиентных клеток, которые включили генетический материал донора. Большинство соответствующих методов позволяют ввести чужеродный материал в одну клетку из тысячи, а то и десяти миллионов, поэтому для отбора нужны весьма эффективные средства. Именно эта стадия зачастую является лимитирующей в ходе эксперимента.
Первые опыты по переносу генетического материала осуществляли с помощью слияния целых клеток. Такая техника нашла применение при изучении процессов дифференцировки и канцерогенеза, однако наиболее успешно ее использовали при картировании генов человека и получении моноклональных антител. Известно, что сформировавшийся при слиянии клеток грызуна и человека межвидовой гибрид спонтанно теряет человеческие хромосомы. Как правило, утрата хромосом происходит случайным образом, и это позволяет конструировать гибридные линии клеток, в которых содержатся разные хромосомы человека. Корреляция между присутствием конкретной хромосомы человека и экспрессией генетического маркера является основой для отнесения соответствующего гена к определенной группе сцепления. Из 1300 генов человека, картированных на сегодняшний день, примерно треть локализована на конкретных хромосомах с помощью методов генетики соматических клеток. Процесс утраты хромосом у внутривидовых гибридов происходит не так быстро, как у гибридов межвидовых. При слиянии клеток мышиной миеломы с клетками селезенки формируются стабильные линии гибридных клеток. Их характеризует иммортальность, унаследованная от миеломных клеток, и способность продуцировать антитела.
Хромосомная нестабильность межвидовых гибридов, сложности при кариотипировании тетраплоидных внутривидовых гибридов ограничивали применение методов генетики соматических клеток для генетического анализа сложных фенотипов. Необходимо было научиться переносить отдельные хромосомы между соматическими клетками. Это удалось сделать с помощью мини-клеток. Несмотря на технические трудности, метод MMGTс успехом использовали для создания гибридов и последующего картирования генов, для анализа процессов дифференцировки и развития опухоли. Такие эксперименты позволили с уверенностью говорить о существовании специфических ^rans-действующих регуляторов, участвующих в формировании фенотипа дифференцированной клетки; кроме того, был подтвержден рецессивный характер гена опухоли Вильмса.
Методы слияния целых клеток и MMGT эффективны для хромосомной локализации гена, возможность более тонкого картирования этими методами ограничена, так как оно требует наличия хромосом с транслокациями и делециями. Для решения этой задачи разработаны два метода: перенос генов, опосредованный хромосомой, и перенос генов в процессе слияния облученной клетки-донора с необлученным реципиентом. Первый способ предполагает инкубацию очищенных митотических хромосом с клетками-реципиентами в присутствии фосфата кальция. При этом происходит встраивание фрагментов донорных хромосом в хромосомы клетки-реципиента. Для идентификации гибридов, содержащих нужные фрагменты ДНК донора, применяют соответствующие методы селекции. К сожалению, встроенные фрагменты хромосом зачастую претерпевают реорганизацию, кроме того, есть достоверные данные о предпочтительном проникновении в клетку и последовательностей из центромерных областей. Эти недостатки не позволяют использовать CMGT для картирования, хотя данный метод весьма эффективен для обогащения специфическими фрагментами хромосом – составной части стратегии клонирования, называемой «обратной генетикой». Госс и Харис впервые показали, что фрагменты Х-хромосомы человека, появляющиеся в его гамма-облученной клетке, можно сохранить при слиянии этой клетки с клеткой грызуна. Углубленный анализ метода IFGT показал, что полученные фрагменты реорганизованы и для них характерна та же тенденция представлять центромерные области, что и при CMGT.
Геномную ДНК можно ввести, добавляя ее очищенный препарат к реципиентным клеткам. Эта процедура также очень важна для анализа функционирования генов в клетках млекопитающих. Разработаны три способа введения ДНК: преципитация с фосфатом кальция, с помощью ретровирусного вектора и микроинъекция. Вероятно, для каждого из них существует предельный размер фрагментов ДНК, которые переносятся без повреждения. Хотя эту гипотезу не подвергали тщательной проверке, скорее всего дело обстоит именно так. Фрагменты длиной более 100 тысяч пар оснований вряд ли можно перенести без потерь, если это вообще возможно. Метод DMGT кроме функциональных исследований используют для случайного встраивания в геном селектируемых генов и для клонирования генов, при селекции которых необходима экспрессия.
1. Общие положения
1.1 Необходимые условия
Условия культивирования клеток должны обеспечивать их максимальную жизнеспособность. Это особенно важно для клеток, используемых в эксперименте по переносу, поскольку данная процедура предполагает использование потенциально токсичных веществ, таких, например, как полиэтиленгликоль.
Успех экспериментов по генетическому переносу во многом определяется эффективностью посева клеток-реципиентов. Следовательно, эффективность посева всех клеточных линий, которые будут использованы в качестве реципиентов, должна быть проверена в условиях, аналогичных экспериментальным. Линии, демонстрирующие эффективность посева менее 10%, не годятся на роль реципиента.
Все манипуляции необходимо проводить в стерильных условиях и со стерильными реагентами. Растворы следует готовить только из реактивов, предназначенных для культивирования клеток, обязательно использовать для этого бидистиллированную воду.
1.2 Селекция
Цель селекции – предоставление определенных преимуществ клеткам, необходимым экспериментатору. Существуют четыре группы методов селекции.
1.2.1 Биохимическая селекция, основанная на эндогенных генах
Наиболее широко распространенный пример такого подхода – НАТ-селекция. В присутствии аминоптерина ингибируется синтез denovo предшественников ДНК. Клетки, лишенные фермента тимидинкиназы, не могут утилизировать экзогенный тимидин и гибнут в присутствии аминоптерина. Аналогично, клетки, лишенные гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, не могут усваивать гипоксантин и также нежизнеспособны в присутствии аминоптерина. Соматические гибриды, полученные при слиянии ТК- , НРКТ+ -кле-ток с клетками ТК+ , HPRT- , могут оказаться одновременно ТК+ , HPRT+. Гибридные клетки с таким генотипом способны расти в присутствии аминоптерина, если гипоксантин и тимидин добавлены в среду. Распространен вариант НАТ-метода, когда один партнер по гибридизации не может размножаться invitro, а другой – является дефицитным по ТК или HPRT. Для исследований в области генетики соматических клеток разработано большое количество систем комплементации. Многие из них основаны на использовании различных ауксотрофных и прототрофных клеточных линий хомячков. Этот подход требует создания подходящих мутантных клеток-реципиентов.
Учитывая важность НАТ-селекции, мы предлагаем вниманию читателей руководство по приготовлению соответствующей среды.
1.2.2 Биохимическая селекция, основанная на экзогенных генах
Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого конструируют плазмидные и ретровирусные векторы, в которых бактериальные гены сочетаются с промоторами, местами сплайсинга и сигналами полиаденилирования млекопитающих. Введение бактериальных генов в клетки млекопитающих с помощью трансфекции или инфекции приводит к их случайному распределению в геноме реципиента. В качестве примера бактериальных генов, способных обеспечивать селективные преимущества клеток млекопитающих, можно назвать ген Е. coligptи генлео. Основной недостаток этого метода – случайное распределение сайтов интеграции; однако последние исследования позволяют надеяться, что с помощью гомологичной рекомбинации удастся осуществлять направленную интеграцию.
1.2.3 Антигены клеточной поверхности
В роли селективного фактора могут выступать антитела. При этом мы получаем возможность выделять клетки с определенным набором антигенов клеточной поверхности. Применение антител лежит в основе ряда методов, среди них отбор клеток с помощью клеточного сортера, розеткообразование с эритроцитами, связанными антителами, избирательное прикрепление клеток к поверхности с иммобилизованными на ней антителами. Хотя эффективность селекции клеток с помощью антител недостаточно высока, тем не менее селекция с использованием антител применяется во всех методах переноса генов, описываемых здесь, за исключением MMGT.
1.2.4 Активированные онкогены
Мутировавшие протоонкогены, особенно члены семейства ras-генов, обеспечивают преимущества в росте клеток млекопитающих и, следовательно, могут быть использованы для селекции.
2. Слияние целых клеток
2.1 Введение
Известно, что при смешивании клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое. Эффективность слияния может быть существенно увеличена с помощью специфических антигенов. Первоначально для этой цели использовали инактивированный вирус Сендай, однако биологическая неоднородность различных партий инактивированного вируса и громоздкость процедуры слияния, индуцированного вирусом, привели к широкому использованию химического индуктора–полиэтиленгликоля. Метод, представленный ниже, пригоден для слияния клеток как одного, так и разных видов животных. Внутривидовые гибриды формируются с частотой 10~5 –Ю-3 . Частота слияния клеток разных видов варьирует от 10~7 до 10~5 . Клетки, имеющие сходные фенотипы и близкие параметры роста, сливаются с более высокой частотой.
2.2 Получение клеточных гибридов с помощью слияния, индуцированного ПЭГ
Таблица 2. Основные растворы, необходимые для слияния клеток
|
Среда для роста клеток Среда для роста клеток без эмбриональной телячьей сыворотки | Обычно мы используем среду Игла, модифицированную Дульбекко, с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, однако состав культуральной среды прямо на процесс слияния не влияет |
| Селективная среда | Культуральная среда, пригодная для селекции гибридных клеток |
| 50%-ный раствор ПЭГ, приготовленный в бессывороточной среде | 5,5 г ПЭГ 4000 н 5 мл бессывороточной среды смешивают и авто-клавируют. Конечный рН доводят до 8,2, раствор нагревают до 37 °С непосредственно перед использованием |
--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--