Дипломная работа: Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК
Рис. 4 . Схема ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующих красителей [7].
Подводя итоги, стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агеннтов весьма привлекательным.
1.1.2 Кинетические параметры
Кинетическая кривая. Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR.
Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5).
Рис 5 . Пример кинетических кривых RealTimePCR(по материалам www.molbiol.ru).
В ней можно выделить три стадии:
1. Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
3. Плато (стадию насыщения).
Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением:
Pn = P0 * E n (1) (www.molbiol.ru),
где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n , P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.
Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:
n = - (1/log E ) * log P0 + log Pn /log E (2) (www.molbiol.ru)
Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T) ) такой цикл n , на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T) =const . Дляn=C(T) уравнение 2 принимаетвид:
C(T) = - (1/log E ) * log P0 + log PC(T) /log E (3) (www.molbiol.ru),
т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата(по материалам www.molbiol.ru).. Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19].
Базовый уровень флуоресценции. Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором:
1. Обеспечивается минимальный уровень флуоресценции до появления репортерного сигнала.
2. Начало экспоненциальной фазы детектируется с наибольшей точностью.
В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.
Для SYBR Green, как правило, хорошо работает расчет базового уровня по среднему значению в диапазоне циклов с 3 по 7 (первые 2 цикла не влючают в диапазон, поскольку на них может наблюдаться более сильная флуоресценция из-за недостаточно стабилизировавшейся реакции).
Более осторожно нужно выбирать базовую линию при TaqMan амплификации, поскольку к началу PCR в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от "сломанных проб" (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если "сломанные пробы" не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). Как уже было сказано выше, в таком случае начальный цикл диапазона нужно выбирать такой, в котором флуоресценция от "сломанных проб" уже достигла минимума .
В некоторых случаях флуоресценция от "сломанных" проб наблюдается и на более поздних стадиях PCR, к 20-25 циклу. Такой эффект нежелателен, поскольку он создает трудности при выборе базовой линии, что может привести к "маскировке" начала экспоненциальной фазы. В таком случае рекомендуется собирать реакцию заранее и инкубировать ее в холодильнике 1 час или более до добавления ДНК (если реакции инкубируются в темноте и при температуре около +4o C, максимальное время инкубации практически неограничено) [20].
Свидетельствами того, что базовый уровень выбран некорректно, являются:
1. Значительное "провисание" кривой флуоресценции ниже нулевого уровня.