Контрольная работа: Аффинность антител и кинетика реакций
Методы тушения биолюминесценции основаны на использовании в качестве маркера АТР, пришитой к' молекуле антигена. В составе такого комплекса молекула АТР сохраняет активность в реакции биолюминесценции, катализируемой светлячковой люциферазой. При добавлении антител образуется комплекс с антигеном, в котором молекула АТР становится недоступной ферменту, в результате чего ингибируется реакция биолюминесценции. Указанный метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет измерять константы ассоциации до 10-12 М.
Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 1.
2. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Этот наиболее простой случай реализуется, например, при связывании гаптена с Fab-фрагмента-ми моноклональных антител и описывается простейшей схемой.
Из системы уравнений материального баланса
с учетом для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентраций образовавшегося комплекса
1. Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации антигена о. Если при достаточно больших концентрациях антигена в системе выполняется условие, то принимает вид
Эта зависимость является аналогом изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции или уравнения Михаэлиса-Ментеи в ферментативной кинетике. Из выражения следует, что при предельных значениях концентрации 0 концентрация комплекса стремится к общей концентрации центров связывания 0 . Для вычисления К определяют концентрацию антигена 'о, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном. С учетом выражений и можно получить
Из выражения следует, что '0 = 1/К при условии 1/К">о. При обратном соотношении данный метод определения К неприемлем.
Зависимость концентрации образующегося комплекса от общей концентрации антигена в растворе
Графическое определение константы связывания в двойных обратных координатах
2. Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости концентрации комплекса от концентрации свободного антигена в системе двойных обратных координат:
При постоянной концентрации антител в системе варьируют начальную концентрацию антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена. График в двойных обратных координатах представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона, отсекающую на оси ординат отрезок 
В условиях избытка антигенаанализ проводят в координатах 1/0 .
3. Наиболее часто для анализа комплексообразования используют метод Скэтчарда, основанный на исследовании зависимости отношения равновесной концентрации комплекса к концентрации свободного антигена от концентрации комплекса.
Аналитический вид уравнения Скэтчарда легко получить из выражения для константы комплексообразования и уравнения материального баланса:
В литературе часто эти координаты обозначают в символах.B/F-i-B. Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона — К, отсекающей на оси ординат отрезок К о, а на оси абсцисс 0 . Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител 0 в системе.
На практике при нахождении константы данным способом проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного антигена при различных начальных концентрациях антигена и постоянной концентрации антител в системе.
4. В качестве еще одного преобразования уравнений и используют следующее:
