Контрольная работа: Аффинность антител и кинетика реакций
В координатах
, называемых координатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке IgK.
Взаимодействие одной субпопуляции антител с поливалентным антигеном. Рассматриваемый ниже случай может реализоваться, например, при связывании Fab-фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела, имеющего позэпитопов, записывается следующим образом:
Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид
Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации о, можно определить константу комплексообразования К и число мест связывания 6 антигене п.
Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы IgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит от концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул IgG в Системе.
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования —Кйи Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения иммуноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.
В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия
описывается системой следующих алгебраических уравнений:
Опуская алгебраические преобразования, дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:
гдеВ = Вй-\-В2 =+; F=. Графическая зависимость B/Fот В имеет вид гиперболы. Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной.
Для определения четырех неизвестных параметров —Кй, Кг, 0 и о можно воспользоваться одним из следующих методов.
1. Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат. Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант Кйи Кя.Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат', была равна соответствующим отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат:
Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат CW дают оценочные значения для0 и о соответственно. Подставляя оценочные значенияКй, Кз, 0 в выражения дляВйи В2
находят приближенные параметры В\ и В% и В=В1 -\-В2 при различных концентрациях Аг.
С использованием полученных значений строят теоретическую зависимость B/Fот В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.
2. Для нахождения асимптот гиперболы можно воспользоваться чисто графическим методом, заключающимся в построении двух прямых PQиНМ, для которых выполняется соотношение
т. е. отрезок OR, соединяющий начало координат с любой точкой R, находящейся на гиперболе, равен сумме отрезков ORiи OR2, соединяющих начало координат с точками пересечения отрезка ORс асимптотами.