Контрольная работа: Технология ферментных препаратов
ВВЕДЕНИЕ
Ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространенны в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.
Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы.
Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т.д.
Большим и неоспоримым достоинством ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 градусов Цельсия и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определенные соединения.
Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и расширяться.
I. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ
Культивирование продуцентов ферментов можно вести поверхностным и глубинным способами. Поверхностным способом можно вырастить только аэробную культуру микроорганизма в основном на твердой сыпучей питательной среде. Глубинным методом выращивают микроорганизмы в жидкой питательной среде, и этим методом можно вырастить как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Подавляющее большинство продуцентов ферментов – аэробы.
На процесс биосинтеза ферментов оказывают влияние условия внешней среды, уровень питательных веществ, их сбалансированность, отвод метаболитов, изменение активной кислотности среды, температуры, насыщенность среды растворенным кислородом, состояние и возраст культуры продуцента. В зависимости от способа культивирования и физиологических особенностей продуцента значимость этих факторов и степень их влияния на процесс биосинтеза ферментов различны, однако некоторые общие закономерности можно выделить.
I.1 Питательные среды для культивирования микроорганизмов
Основным требованием, предъявляемым к составу питательной среды, является ее полноценность для роста продуцента и обеспечения синтеза целевого продукта. Микроорганизмам нужны соединения, содержащие углерод, азотистые вещества, водород, кислород. В состав среды должны входить такие минеральные вещества, как магний, кальций, фосфор, сера, железо, калий и некоторые другие. Состав среды для того или иного микроорганизма различен, однако все продуценты ферментов усваивают углерод преимущественно в виде органических соединений, водород – в виде воды и в составе органических соединений, кислород – из основного состава среды и в молекулярном виде. Питательные вещества среды расходуются микроорганизмами не только на построение растущей клетки, но и на обеспечение энергией основных жизненных процессов.
Микроорганизмы очень чувствительны к составу среды, на которой растут, причем одни соединения они потребляют интенсивно, а другие остаются почти неиспользованными. Следует помнить, что не всегда интенсивный рост микроорганизма способствует максимальному накоплению ферментов.
Так как подавляющее большинство продуцентов ферментов является аэробами, почти все углеводы потребляются ими путем окисления и основными продуктами метаболизма являются диоксид углерода и вода. Накапливающиеся в процессе роста культуры промежуточные продукты окисления, такие, как кетокислоты, ди- и трикарбоновые кислоты, альдегиды, служат по мере потребления углеводов основным источником углерода в среде. Если состав среды подобран верно и процесс ведется правильно, то избыточного накопления промежуточных продуктов не происходит. Хорошим источником углерода в среде могут быть жиры и масла. Это следует помнить при использовании жировых пеногасителей. В процессе культивирования, пока в среде есть жир, наблюдается образование жирных кислот, и среда заметно подкисляется. Микроорганизмы потребляют также органические кислоты и спирты.
Источником азота для микроорганизмов – продуцентов ферментов могут быть сложные органические вещества, их гидролизаты и минеральные соли. Богаты азотными веществами кукурузный экстракт, соевая и пшеничная мука, гидролизат казеина и т.д. Минеральный азот в среде обычно представлен аммонийными солями и нитратами. Органические соединения и аммонийные соли содержат азот в восстановленной форме, поэтому он легко и быстро потребляется. Азот же нитратов должен быть сначала восстановлен и потом уже усвоен микроорганизмами. Поэтому при их совместном присутствии в среде большая скорость потребления аммонийного азота, чем нитратного. Введение аммонийных солей приводит к подкислению среды (в растворе остается анион кислоты), при введении нитратов среда подщелачивается (в растворе остается катион соли). Большое значение для биосинтеза ферментов имеет сбалансированность питательной среды по углероду и азоту. Источником витаминов и ростовых веществ в питательных средах обычно являются микробные массы и различные растительные отходы. Большое влияние на синтез ферментов оказывает присутствие в среде минеральных элементов, которые необходимы микроорганизму в макро- и микроколичествах. Фосфор и сера входят в состав важнейших веществ клеток – нуклеотидов, белков, липидов, витаминов. Фосфор участвует во многих реакциях обмена веществ в клетке, стимулирует биосинтез протеаз, амилаз, пектолитических ферментов. Такие элементы, как железо, цинк, медь, кобальт и некоторые другие, требуются для синтеза ряда ферментов и белков в ничтожно малых количествах. Повышенное содержание микроэлементов часто приводит к торможению нормального роста и жизненных процессов клетки. Большая часть микроэлементов вносится в среду с водой и органическими добавками – с мукой, кукурузным экстрактом, жмыхом и т. д. Макроколичества минеральных элементов могут быть введены в состав среды, но необходимо учитывать, что минеральные соли содержаться в естественных продуктах, входящих в состав сред.
Очень часто в среды вносят мел, который связывает образующиеся кислоты, за счет чего происходит регулирование кислотности среды, а также служит дополнительным источником микроэлементов. Металлы и их комплексные соединения являются биологически важными компонентами. Микроэлементы могут регулировать обменные процессы в организме и изменять направление ферментативных реакций.
Присутствие или отсутствие отдельных микроэлементов может оказывать стимулирующее действие на накопление в среде определенных ферментов. Варьируя состав среды с учетом физиологических особенностей продуцента и индуцированного характера синтезируемых ферментов, можно получить поверхностную культуру, содержащую желаемый комплекс ферментов.
I.2 Величина рН среды
При поверхностном культивировании рН среды меньше влияет на процесс образования ферментов, так как в силу высокой буферности и малой влажности среды он почти не изменяется. Влияние рН среды при глубинном культивировании микроорганизмов огромно, причем большое значение имеет не только его исходная величина, но и изменение его при стерилизации и в результате потребления катионов или анионов среды в процессе жизнедеятельности микроорганизмов. В результате такого потребления происходит либо подщелачивание, либо подкисление культуральной жидкости.
Оптимальное исходное значение рН среды зависит от особенностей продуцента, но можно выделить общие закономерности. Грибы и дрожжеподобные организмы хорошо растут и образуют ферменты в средах с рН от 3,8 до 5,6. Бактерии лучше всего развиваются при рН, близком к нейтральному (6,2-7,4). В зависимости от состава среды и продуктов метаболизма рН среды может сдвигаться как в кислую, так и в щелочную зону. Большинство микроорганизмов очень чуствительно к уровню рН среды, и малейшее отклонение значения рН от оптимального приводит к резкому снижению способности микроорганизмов образовывать ферменты.
I.3 Температура культивирования
Большинство продуцентов ферментов, особенно микроскопические грибы, является мезофильными микроорганизмами, и оптимальная температура их развития равна 22-32 градуса С. Среди бактериальных продуцентов ферментов часто встречаются термофильные микроорганизмы, для которых оптимальная температура культивирования составляет 35-55 градусов С. Термофильные микроорганизмы представляют особый интерес для промышленного использования, так как культивирование при высоких температурах создает селективные условия для их развития и позволяет снизить требования к стерильности процесса. Кроме того, термофильные микроорганизмы синтезируют ферменты, обладающие повышенной термостойкостью. Температура оказывает большое влияние на скорость накопления ферментов. Если микроорганизм термостабилен, то с повышением температуры культивирования возрастает скорость накопления фермента, а иногда и суммарное количество синтезируемого фермента.
I.4 Влажность питательной среды при поверхностном культивировании
Влажность среды при выращивании продуцента ферментов на твердых сыпучих средах имеет большое значение, так как при влажности среды от 11 до 20% развитие микроорганизмов почти невозможно.
Небольшой рост начинается при влажности свыше 30%. Влажность 40-45% считается неблагоприятной и способствует обильному спорообразованию культуры. При влажности среды 53-68% наблюдается наибольшее накопление ферментов. Оптимальная влажность зависит во многом от продуцента, но в основном от физического состояния среды при данной влажности. При влажности 60-68% наблюдается спад биосинтеза ферментов из-за ухудшения проницаемости среды для воздуха. Высокая влажность способствует слипанию частиц среды, нарушению рыхлой структуры и ухудшению условий роста культуры и биосинтеза ферментов. При поверхностном культивировании с ростом культуры происходит заметное уменьшение содержания сухих веществ, которые превращаются в СО2 и Н2О. Если культивирование ведется в закрытых емкостях, где испарение влаги ограничено, то по мере роста культуры наблюдается некоторое увеличение влажности. Если культура выращивается в открытых емкостях при интенсивном аэрировании, то наблюдается ее подсушивание, которое может повлечь за собой уменьшение продуцирующей способности культуры и снижение активности в готовом продукте.
Оптимальная влажность и ее уровень при культивировании во многом зависят от физиологических способностей продуцента, состава среды и ее сыпучести, и в каждом конкретном случае определяются экспериментально.
I.5 Аэрирование растущей культуры
Степень аэрирования во многом определяется способом культивирования и физиологией микроорганизмов – продуцентов ферментов. Аэрирование растущей культуры преследует три цели: снабжение микроорганизма необходимым для роста и развития количеством кислорода; удаление с отходящим воздухом газообразных продуктов обмена; частичное снятие и отвод выделяемого микроорганизмом в процессе роста физиологического тепла. При поверхностном культивировании самое большое значение придается вопросу отвода воздухом тепла. Чем интенсивнее аэрирование, тем глубже идут окислительные процессы, больше потребляется сухого вещества среды на дыхание и тем меньше выход готовой культуры. Процесс интенсивного окисления органических веществ среды сопровождается выделением большого количества тепла.
Для расчета необходимого воздухообмена обычно строят график тепловыделения за весь период выращивания микроорганизма, так как в зависимости от состава среды и вида микроорганизма кривые тепловыделения будут различны. Расход воздуха при поверхностном способе культивирования для снятия тепла приблизительно в 90-100 раз превышает физиологическую потребность в нем микроорганизмов, поэтому процесс подвода О2 к культуре и отвода углекислоты не является лимитирующим.
Аэрирование глубинной культуры является важным фактором и его интенсивность по-разному влияет на продуцирующую способность различных микроорганизмов. Даже один и тот же микроорганизм при различной степени аэрирования неодинаково накапливает отдельные ферменты. В целом же увеличение степени аэрирования среды приводит к интенсификации процесса биосинтеза ферментов и в большинстве случаев к сокращению длительности культивирования.