Курсовая работа: Бифидобактерии и использование их в молочной промышленности
Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y- или V-формы, булавовидные, лопатовидные. Клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками, палисадом или розетками, размер клеток 0,5-1,3 х 1,5-8 мкм. Грамположительные, не образуют спор и капсул, неподвижные. Микроскопическая картина каждого вида бифидобактерий имеет особенности по размеру, форме и расположению клеток.
При выращивании культур бифидобактерий на печеночном агаре или в молоке ветвление исчезает, клетки становятся грамвариабельными, слабее окрашиваются кислыми и щелочными красителями, появляется много гранулированных форм, которые иногда можно принять за кокки. Грануляция у бифидобактерий наблюдается также в средах с высоким содержанием сухих веществ.
Ветвление происходит в среде, неполноценной в отношении источников питания. Появление полиморфных клеток у бифидобактерий индуцируется и катионами одновалентных металлов: калия, натрия, лития, цезия, а также исключением из среды культивирования одной из четырех аминокислот: DL-аланина, DL-серина, DL-аспарагиновой кислоты, L(+)-глутаминовой кислоты, смесь которых предотвращает ветвление клеток.
Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы; ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста. На ранних стадиях развития у бифидобактерий преобладают палочковидные формы, а при дальнейшем культивировании образуются разветвленные нити с многочисленными перегородками в основном стволе и ответвлениях.
Культуральные свойства
Все виды бифидобактерий при первичном выделении являются строгими анаэробами. В присутствии углекислого газа они могут быть толерантными к кислороду. При лабораторном культивировании эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а в высокопитательных средах - расти в полностью аэробных условиях. Чувствительность к кислороду у многих штаммов бифидобактерий варьирует, что обусловлено различиями в механизме брожения. Некоторые виды могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10 % ССЬ. Оптимальной является температура 37-41 °С. Оптимальное значение рН 6-7, при рН ниже 4,5 и выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается.
Размножение бифидобактерий обусловлено огромным количеством факторов роста. Многие виды нуждаются в биотине, пантотеновой кислоте, цистеине, рибофлавине, пуриновых и пиримидиновых основаниях, пептидах, аминосахарах, коферменте А, олигосахаридах, некоторых ненасыщенных жирных кислотах и др. Отдельные штаммы нуждаются в углекислом газе, аммиаке, гистидине. Из аминокислот требуется лизин, пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Некоторые штаммы бифидобактерий растут при наличии азотфиксирующих олигосахаридов - N-ацетил-глюкозамина, N-ацетил-галактозамина, N-ацетил-маннозамина и др, которые отсутствуют в коровьем молоке (содержатся в женском молоке).
В синтетических средах бифидобактериям для роста необходимы железо, магний, фосфаты, хлориды калия и натрия, в некоторых случаях -марганец.
Бифидобактерии культивируют, создавая анаэробные условия или снижая окислительно-восстановительный потенциал среды, на молоке, гидролизованном молоке и гидролизате казеина, а также на печеночном бульоне с добавлением ростовых веществ (дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта, цистеина и др.). На плотных питательных средах бифидобактерии образуют разнообразные колонии: плоские, полушаровидные, блестящие, шероховатые, окруженные валиком, имеющие более темный центр и т.д. Цвет колоний изменяется от белого и серого до темно-коричневого. Колонии часто напоминают по форме зерно гречихи или усеченную треугольную пирамиду, на некоторых средах колонии имеют форму чечевичек. Размеры колоний от 0,5 до 5 мм.
В молоке бифидобактерии развиваются медленно, так как коровье молоко не является естественной средой их обитания. Одной из причин плохого роста бифидобактерий в молоке служит растворенный в нем кислород. У них не обнаружено казеолитической активности, т.е. они могут усваивать казеин только после частичного гидролиза. В результате расщепления казеина образуются полипептиды, гликопептиды, аминосахара, стимулирующие рост бифидобактерий. Другой причиной заторможенного роста бифидобактерий может быть и их низкая фосфатазная активность.
Рост бифидобактерий в коровьем молоке стимулируют экстракты дрожжей, гидролизованное молоко, а также увеличение соотношения белок: лактоза. Сильный стимулирующий эффект роста бифидобактрий получают при использовании гидролизатов казеина.
Растительными стимуляторами роста бифидобактерий в молоке являются обезжиренная соя, экстракт картофеля, тростниковый сахар, кукурузный экстракт, морковный сок. В качестве стимуляторов роста применяют также соли железа, сорбит, микроэлементы в виде сернокислой меди и лактата железа.
Одним из способов активации роста бифидобактерий в молоке является получение мутантов этих микроорганизмов, способных расти без какой-либо защиты от кислорода.
Для культивирования бифидобактерий наиболее распространенной считается печеночно-цистеиновая среда (среда Блаурока).
Для ее приготовления 500 г говяжьей печени, освобожденной от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством воды и кипятят в течение 2 ч, затем отфильтровывают. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1 000 см и вносят 10 г пептона, 10 г лактозы, 100 мг хлористого цистеина, 5 г NаС1 и агара 1-2 г. рН среды 6,8-7,0. Однако эта среда дорога, содержит дефицитные компоненты, поэтому мало пригодна для использования в промышленных условиях.
В молочной промышленности для выявления бифидобактерий рекомендована гидролизатно-молочная среда (ГМ-среда). Для ее приготовления в небольшом количестве разведенного гидролизованного молока (гидролизата) расплавляют агар из расчета 2,5 г. на 1 дм3 приготовленной среды. К остальному количеству гидролизата добавляют 20 г. пептона и 3,5 г. хлористого натрия, смесь нагревают до температуры 80°С, после чего соединяют с расплавленным агаром. Устанавливают рН 7,5 и смесь кипятят в течение 15 мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10 г. лактозы и 0,15 г. солянокислого цистеина. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 10 см3 и стерилизуют при температуре 112 °С в течение 30 мин.
Биохимические свойства
Бифидобактерии являются хемоорганотрофами, активно сбраживают сахарозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, мелибиозу, раффинозу, лактозу и др. с образованием в основном уксусной и молочной кислот в молярном соотношении 3 : 2. Образуются также примеси муравьиной и янтарной кислот, а также этанола. Масляную, пропионовую кислоты и ССЬ не образуют.
Бифидобактерии не продуцируют каталазы, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты, не разжижают желатин. Они не продуцируют фенол, не образуют аммиак из аргинина. При развитии в лакмусовом молоке бифидобактерии вызывают частичное или полное его восстановление. Эти микроорганизмы способны развиваться в бульоне из гидролизованного молока с 2%-ным раствором поваренной соли, 20 °/с желчи, концентрацией фенола
1 : 250. Цитраты в качестве источника энергии бифидобактерии не используют.
Большинство штаммов бифидобактерий не сквашивают стерильное молоко или сквашивают его через 4 сут и более. В процессе культивирования биохимическая активность микробов повышается и свертывание молока происходит через 24-36 ч. Биохимическая активность повышается также при добавлении в молоко ростовых веществ. При внесении 5-10 % посевного материала сквашивание наблюдается через 8-12 ч. Предельная кислотность достигает 120-130 ° Т.
Кроме кишечника теплокровных бифидобактерии обнаружены в ротовой полости, также у насекомых и в сточных водах.
Бифидобактерии применяют при изготовлении кисломолочных продуктов для детей раннего возраста и пробиотиков для людей и животных, так как способствуют нормализации микрофлоры кишечника. Они сообщают продукту диетические и лечебные свойства, так как синтезируют витамины группы В (В1 В2 , В6 , В , фолиевую кислоту), витамин К, также незаменимые аминокислоты, при этом в качестве азота используют аммиак. Эти микроорганизмы разрушают канцерогенные вещества, образуемые некоторыми представителями кишечной микрофлоры при азотном обмене, выполняя, таким образом, роль «второй печени».
Бифидофлора играет важную роль в жизнедеятельности человека, поддерживая его здоровье на оптимальном уровне. Она является преобладающей микрофлорой в кишечнике. В 1 г. содержимого толстого кишечника взрослого человека обнаруживают несколько миллиардов клеток бифидобактерий.
Продукты с бифидобактериями
Продукты, обогащенные бифидобактериями, характеризуются высокими диетическими свойствами, так как содержат ряд биологически активных соединений: свободные аминокислоты, летучие жирные кислоты, ферменты, антибиотические веществ, микро- и макроэлементы.