Реферат: Адсорбционная хроматография
С чем это связано? Как правило, разделения, которые проводят на оксиде алюминия, легко могут быть перенесены на силикагель или же на привитофазные полярные сорбенты на его основе. Химическая же однородность поверхности силикагеля выше. Каталитическая активность оксида алюминия значительно выше, он гораздо чаще вызывает разложение компонентов пробы или их необратимую сорбцию. При одинаковой цене за грамм в колонку с оксидом алюминия требуется его в два раза больше по массе, чем силикагеля, что вдвое дороже.
Можно считать, что в настоящее время использование оксида алюминия в качестве адсорбента в какой-то мере стимулируется тем, что многие исследователи его имеют и используют, когда пытаются перейти от ТСХ разделений на оксиде алюминия к ВЭЖХ варианту. Используют его и в тех случаях, когда воспроизводят опубликованные более ранние работы.
Однако следует признать, что, за исключением некоторых особых случаев применения, когда сорбенты на основе оксида алюминия показали повышенную селективность по сравнению с силикагелем (например, в разделении многоядерных ароматических углеводородов, некоторых аминов), применение силикагеля более целесообразно.
Недостатки адсорбционной хроматографии, ограничивающие ее использование.
Популярность адсорбционной хроматографии по мере развития метода ВЭЖХ постепенно падала, она все больше заменялась и продолжает заменяться на другие варианты, такие, как обращенно-фазная и нормально-фазная ВЭЖХ на сорбентах с привитой фазой. Какие же недостатки адсорбционной хроматографии привели к этому?
Прежде всего, это большая длительность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких растворителей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из этого следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности. По этой же причине невозможно использовать градиентное элюирование — возврат к исходному состоянию настолько длителен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.
Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необратимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмечались в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция, имеющая место и в этом случае, приводит к получению хроматограммы, на которой полностью или частично отсутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому разложению компоненты пробы.
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически первыми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на начальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесенной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также уменьшался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.
Логическим оказалось привить химическими связями жидкую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физически невозможен, т.е. превратить носитель и фазу в одно целое — в так называемый привито-фазный сорбент.
Первые привито-фазные сорбенты были получены замещением силанольных групп, находящихся на поверхности силикагеля, в результате их реакции со спиртами или аминами. При этом отщеплялась вода, а остатки спиртов или аминов химически прививались к поверхности силикагеля. Эти так называемые «щеточные» сорбенты показали, что с их использованием действительно удается получить высокую эффективность колонок при отсутствии уноса фазы из колонки и стабильности времен удерживания. Однако устойчивость таких сорбентов в условиях применения водных растворителей и даже слабоосновных или кислых сред была низкой: фаза отщеплялась химически за счет реакции гидролиза.
В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как полярными, так и неполярными группами на поверхности.
Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными производителями. Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей технологии, которая обычно составляет «ноу-хау» производства. В результате большое количество сорбентов, называющихся химически совершенно одинаково (например, силикагель с привитым октадецилсиланом), имеют очень сильно различающиеся хроматографические характеристики. Это связано с тем, что силикагель может иметь поры шире или уже, разную поверхность, пористость, его поверхность до прививки может гидроксилироваться или нет, прививаться могут моно-, ди- или трихлорсиланы, условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой фазы, используются разные методы удаления остатков реагентов, может использоваться или не использоваться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп.
Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии на одной фирме-производителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хроматографические характеристики. Особенно это касается тех случаев, когда такие сорбенты используют для анализа многокомпонентных смесей, содержащих вещества, заметно различающиеся по количеству и положению функциональных групп, по роду функциональности [9, 10].
Учитывая вышеуказанное, всегда следует стремиться к тому, чтобы при использовании описанной в литературе методики анализа применять именно тот самый сорбент и те же условия работы. В этом случае вероятность того, что работу не удастся воспроизвести, является минимальной. Если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогичной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребуется длительная работа по переделке методики. При этом существует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже и после длительной разработки можно не добиться требуемого разделения. Наличие в литературе многих описанных методик разделения на давно производимых старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и применение по этой причине. Однако в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно применительно к веществам, склонным к разложению, хемосорбции, перегруппировкам, целесообразно начинать работу на сорбентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однородное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более совершенные окончательные стадии обработки сорбентов.
Перейдем теперь к рассмотрению групп привито-фазных сорбентов, являющихся в настоящее время основными в ВЭЖХ, а также сорбентов с нанесенными фазами для распределительной хроматографии.
Нормально-фазная распределительная хроматография с привитыми фазами.
Недостатки, присущие адсорбционной хроматографии и подробно рассмотренные в разделе 2.1.3, а также стремление исследователей преодолеть недостатки, характерные для распределительной хроматографии с нанесенными полярными фазами, способствовали разработке сорбентов с привитыми полярными фазами. Такие сорбенты, по крайней мере основных типов, нашедших наиболее широкое применение, в настоящее время выпускаются большинством производителей.
Основными привитыми фазами для нормально-фазной распределительной хроматографии в настоящее время являются нитрильная и аминная. Каждая из них прививается с использованием соответствующего силана (диметиламинопропилхлор или диметилцианпропилхлорсилана). Нитрильная и аминная привитые фазы могут быть поэтому использованы в двух вариантах: для нормально-фазной (с неполярными элюентами) и обращенно-фазной (с полярными элюентами) распределительной ВЭЖХ. В качестве нормально-фазных сорбентов они работают, подобно силикагелю или оксиду алюминия, с теми же элюотропными рядами
Рис. 2. Хроматограмма витаминов в пищевых продуктах, полученная на колонке размером 250x4 мм с нуклеосилом NH2 (10 мкм), подвижная фаза — гептан — хлороформ (80:20 по объему), расход 3,5 мл/мин, детектор—УФ (254 нм), проба 5 мкл: 1 — уксусный эфир витамина А; 2 — витамин Е; 3 — витамин Д3
растворителей и близкими (но не идентичными) порядками элюирования соединений разных классов. За счет разной химической природы силанольных, амино- и нитрильных групп нередко возникает различие в селективности разделения, позволяющее отдать предпочтение тому или иному сорбенту.
Основными преимуществами сорбентов с привитыми нитрильными или аминогруппами по сравнению с адсорбентами являются следующие: 1) вследствие отсутствия силанольных групп вероятность необратимой адсорбции веществ заметно уменьшается; 2) заметно уменьшается влияние воды на хроматографическое разделение, отпадает необходимость строго контролировать содержание воды в растворителях; 3) быстро достигается равновесие с новым составом растворителя, что позволяет быстро переходить от методики к методике или успешно использовать градиентное элюирование; 4) возможно использование растворителей в широком диапазоне полярностей, колонки легко могут быть регенерированы; 5) сорбенты с привитыми аминогруппами проявляют свойства слабых анионообменников.
Следует принимать во внимание и некоторые особенности применения сорбентов с аминофазами. Не рекомендуется использовать в качестве растворителей и компонентов проб вещества с альдегидными или кетонными группами, так как в этом случае возможно разрушение структуры привитой фазы с образованием оснований Шиффа или исчезновение некоторых компонентов проб. Аминофаза может быть легко окислена, поэтому следует исключить действие на сорбент сильных окислителей. Аналогично, при использовании нитрильной привитой фазы следует поинтересоваться, не реагируют ли с нитрилами выбранный растворитель или компоненты, входящие в состав пробы.
Нитрил и аминофазы применяют в биологии, медицине, биохимии, фармакологии и др. (рис. 2). Эти фазы нашли наиболее широкое признание и выпускаются почти всеми производителями сорбентов Некоторые фирмы выпускают варианты аминофаз, содержащие, например, диэтиламиноэтильные или диметиламино-пропильные группы.
Достаточно широко применяют также еще одну привитую полярную фазу — так называемую «диольную», или просто «диол», которая содержит в составе привитой группы две гидроксильные группы. Ее селективность также будет несколько отличной из-за другой химической природы полярных групп. Сорбенты с такими привитыми фазами выпускают значительно меньшее число производителей.
Сорбенты с другими привитыми полярными группами (за исключением ионообменников) выпускаются еще меньшим числом фирм или же всего одной-двумя, а их применение также достаточно редко. Это связано с тем, что какая-то особая селективность, оправдывающая их применение (рис. 2.6), отмечается довольно редко. С чем же связано то, что многие привитые полярные фазы разных типов, которые были разработаны и даже производились, не приобрели заметной популярности? Ведь в ГЖХ этот путь является основным, позволяющим добиться разделения на колонке — новая фаза с особыми свойствами, дающая высокую селективность.
Рис. 3. Хроматограмма моносахаридов, полученная на колонке размером 250x4,6 мм с полигосилом 60 NH2 (5 мкм), подвижная фаза —ацетонитрил — вода (75:25 по объему), расход 2 мл/мин, детектор — УФ (190 нм): 1 — рамноза; 2 — ксилоза; 3 — арабиноза; 4 — фруктоза; 5 — манноза; 6 — глюкоза; 7 — галактоза