Реферат: Адсорбционная хроматография

Рис. 4. Хроматограмма цитохромов Ц разного происхождения, получен-ная на колонке размером 250х4 мм с нуклеосилом CN (5 мкм), подвижная фаза — 0,05 М раствор сульфата натрия в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 2,0) — ацетонитрил (77,5:22,5 по объему), расход 1 мл/мин, детектор — УФ (400 нм): 1 — лошади; 2 — быка; 3 — собаки; 4 — тунца

Рис. 5. Хроматограмма полициклических углеводородов, полученная на колонке размером 150x4,6 мм с нуклеосилом NO2 (5 мкм), подвижная фаза — изооктан, расход 1,4 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл:

1 — бензол; 2 — нафталин: 3 — фенантрен; 4 — флюорен; 5— пирен; 6 — 1,3,5 -трифенилбензол; 7 — хризен

Главная причина в том, что в ГЖХ молекулы разделяемого вещества вступают во взаимодействие с неподвижной фазой непосредственно, а в ВЭЖХ — только через молекулы сольватированного растворителя, которого тем больше (а влияние привитой группы — слабее), чем больше сольватирующие способности растворителя и сольватируемость полярных групп привитой фазы. Хотя природа привитых полярных групп (нитрил, амин, диол) заметно различается, нивелирующее действие сольвата-ционных оболочек сглаживает эти различия. Поэтому улучшение разрешения заменой сольватирующей полярную группу молекулы или группы молекул на новую путем модификации состава растворителя, введения новых компонентов растворителя или добавок к нему (при сохранении той же привитой полярной группы) часто не только проще для хроматографиста, но и дает существенно более значимый результат.

Обращенно-фазная распределительная хроматография с привитыми фазами

Вариант распределительной хроматографии, в котором используют сорбент с привитыми неполярными (как правило, длинными алкильными или алкилсилильными) группами и полярный растворитель, например водный метанол, получил название обращенно-фазной ВЭЖХ. Этот не совсем удачный термин, указывающий на перемену полярности неподвижной и подвижной фаз на противоположные в данном варианте ВЭЖХ прижился и стал общепринятым, означающим: подвижная фаза полярна, неподвижная — неполярна. В отличие от недостаточно удачного названия сам метод оказался настолько удачным, что в настоящее время является основным в ВЭЖХ. По общим оценкам, каждые два разделения из трех, появляющихся в литературе и используемых в практической работе, относятся к обращенно-фазной ВЭЖХ в ее разных вариантах, т.е. 60—70% работы в данное время проводят этим методом. В чем же причина такой популярности обращенно-фазной хроматографии, что на все остальные варианты ВЭЖХ (адсорбционную, распределительную нормально-фазную, ионообменную, эксклюзионную и другие) приходится менее одной трети применений?

Причин таких несколько, и каждая сыграла роль в широком использовании метода обращенно-фазной ВЭЖХ. Были разработаны и быстро внедрены в производство сорбенты для этого метода, имеющие привитые алкилсилильные группы разной длины (от С2 до Саг с прямой алкильной цепью, фенильной и ди-фенильной группами). Растворители, используемые для этого метода (ацетонитрил, метанол, вода, в меньшей мере — тетра-гидрофуран), позволяют работать в широком УФ-диапазоне, так как они УФ-прозрачны со 190-210 (ТГФ — с 220) нм. Это позволяет применять наиболее популярный детектор — УФ-спектрофотометр как при 190-210 нм, где он детектирует неселективно, и поэтому приближается к универсальному детектору (анализ Сахаров, жиров, сложных эфиров, спиртов, олефинов), так и при любой длине волны, обеспечивающей селективное детектирование (например, витамина А при 325 нм). Растворители, используемые в обращенно-фазных разделениях, относительно легко растворяют практически все важнейшие группы веществ, находящихся в организме человека, биологических объектах, используемых в виде лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов широко используемых в органической химии, нефтехимии, биоорганической химии (рис. 2.7-2.10). Сорбенты в обращенно-фазной ВЭЖХ быстро приходят в равновесие

Рис. 7. Хроматограмма смеси ароматических углеводородов, полученная на колонке размером 250х4,6 мм с зорбаксом ОДС (6 мкм), подвижная фаза — метанол — вода (90:10 по объему), расход 1,5 мл/мин, детектор УФ (254 нм), проба 20 мкл: 1 — толуол; 2 — о -ксилол; 3 — трет -бутилбензол; 4 — n-трет -бутилтолуол; 5 — n-трет -амил-толуол; 6 — n-трет -гексилтолуол; 7 — 3,5-ди-трет -бутилтолуол; 8 — трет -гексил-о-ксилол

Рис. 8. Хроматограмма натурального кофе, полученная на колонке размером 150х4,6 мм с нуклеосилом С8 (5 мкм), подвижная фаза — метанол — 0,01 М фосфатный буферный раствор с рН 7,0 (20:80), расход 1,2 мл/мин, давление 12 МПа, температура 25 °С, детектор Уф (280 нм), проба 20 мкл: 1 — кофеин

с новыми растворителями и при изменении состава растворителя, что позволяет переходить от одной методикики к другой с использованием одной и той же колонки, а

также широко применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем.

Сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы).

Регенерация растворителей высокой чистоты может быть осуществлена с использованием четкой ректификации. Загрязненный сорбент в колонке может быть промыт и приведен снова в рабочее состояние при прокачивании через колонку растворителей, удаляющих загрязнения.

Однако в обращенно-фазной хроматографии существуют и некоторые проблемы, которые нужно принимать во внимание и которые часто затрудняют, особенно для начинающих, использование метода.

Прежде всего, характеристики удерживания и селективности для обращенно-фазных сорбентов меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сорбенту другого (например, от сферисорба ОДС к партисилу ОДС), формально определяемых как идентичные (силикагель с привитым октадецилсиланом).

Эти характеристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной партии сорбента к другой партии того же производителя.

Проблема эта была отмечена еще в самом начале производства и применения обращенно-фазных сорбентов, однако она не решена и до настоящего времени в полном объеме.

Для прививки фаз, которые далее называют одинаково, применяют разные агенты, при этом их чистота (технических сортов, используемых для производства) также различна.

Напри мер, для получения привитой фазы ОДС (октадецилсилан) используют

Рис. 9. Хроматограмма смеси полибромсодержащих антипиренов, полученная на колонке размером 250х4,6 мм с зорбаксом ОДС, подвижная фаза — метанол, расход 1 мл/мин, детектор—УФ (254 нм), проба 10 мкл: 1 — гексабромбутен-2; 2 — гексабромбензол; 3,4 — примеси; 5 — декабромдифенилоксид

октадецилтрихлорсилан, метилоктадецилдахлорсилан и диметил-октадецилхлорсилан. Если используют ди- или три-функциональные силаны, то в зависимости от степени безводности растворителей и силикагеля, на поверхности может получиться мономерная пленка фазы (монослой) или же полимерная (чем больше воды, тем выше степень полимеризации). Свойства мономерной и полимерных пленок с разной степенью полиме-

ризации заметно различаются. Наконец, силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которым прививается фаза, не могут из-за пространственных затруднений быть полностью замещены, например, диметилоктадецилсилильными группами: в самых жестких условиях прививки удается заместить примерно половину силанольных групп. Остающиеся силанольные группы не удается полностью устранить даже в процессе так называемого окончательного покрытия поверхности силикагеля («энд кэппинга»), когда используют молекулы более активного низкомолекулярного силана (обычно триметилхлорсилана). Силанольные группы на поверхности такого привитого сорбента могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в некоторых случаях быть основным фактором, отвечающим за удерживание. Нередко они действуют не непосредственно, а через посредство малых поляризуемых молекул растворителя (метанола, воды), сольватированных силаноль-ными группами. В некоторых случаях, когда в удерживании вещества участвуют как привитые, так и силанольные группы, это приводит к образованию хвостов пиков.

Интересно проследить, как производители сорбентов меняли свои программы по мере развития представления о химии поверхности привитых сорбентов и о роли силанольных остаточных групп. Например, фирма «Ватман» первоначально выпускала только один сорбент вида ОДС — партисил ОДС, который был одним из первых появившихся в продаже обращенно-фазных сорбентов и широко применялся. Однако содержание углерода в нем составляло только 5%, и степень покрытия поверхности составляла 50% от возможной. Далее был выпущен партисил ОДС-2, который содержал уже 15% С, но степень покрытия поверхности увеличилась только до 75%, т.е. покрытие стали получать более плотное, и пленка стала полимерной. Последним появился партисил ОДС-3, содержащий 10% углерода, однако со степенью покрытия 95%. Это достигнуто за счет того, что привитая фаза стала мономерной и окончательное покрытие проводилось дополнительно. Аналогично партисилам ОДС выпущены сферисорбы ОДС и ОДС-2, Р-силы С18 двух типов («высокой прививки» и «низкой прививки»). Те же производители сорбентов, которые появились на рынке позже и использовали технологию, учитывающую недостатки старых сорбентов и технологий их получения, как правило, сразу выпускали сорбент с максимальным покрытием поверхности мономерным слоем фазы, а для устранения остаточных силанольных групп пользовались окончательным покрытием.

У начинающего хроматографиста сразу возникает вопрос: почему производители не заменяют старый сорбент, который вроде бы хуже, на новый, а выпускают новый дополнительно? Второй вопрос, так же естественно возникающий: если есть новые, более совершенные сорбенты с улучшенной химией поверхности, то почему продолжают производить и покупать старые сорбенты, например лихросорб РП-18, при этом часто по ценам, даже более высоким? Конечно, причина не в том, что старые сорбенты хорошо и умело рекламируются: та же фирма «Ватман» рекомендует теперь партисил ОДС как «уникальный сорбент, работающий и по механизму обращенно-фазной, и по механизму aдcоpбциoннoй хроматографии», партисил ОДС-2 — как «рабочую лошадку исследовательской лаборатории, стабильно и длительно работоспособную», а партисил ОДС-3, естественно, как «наиболее инертную обращенную фазу с оптимальным покрытием и наименьшим влиянием остаточных силанольных групп».

Причина в том, что не только производители, но и хроматографисты заинтересованы в выпуске старых сорбентов наряду с новыми, более совершенными. Приобретая старый сорбент, хроматографист приобретает и возможность использовать все имеющиеся в литературе разработки, выполненные на этом сорбенте. Переход на другой сорбент, как правило, сопряжен с большими затратами труда и времени на переработку и доводку методики — нередки случаи, когда после длительной работы исследователь убеждается в том, что на новый сорбент перенести методику не удается. Каждый сорбент в чем-то уникален по свойствам, и полное совпадение их у двух сорбентов хотя в принципе и возможно, однако маловероятно. Поэтому чем больше выбор сорбентов и заполненных ими колонок у исследователя, тем легче ему работать, тем легче использовать накоп-