Фотоколориметрія і спектрофотометрія засновані на взаємодії випромінювання з однорідними системами, і їх звичайно поєднують в одну групу фотометричних методів аналізу.

3. Принципи фотометрії

У фотометричних методах використовують виборче поглинання світла молекулами аналізованої речовини. Відповідно до квантової механіки світло являє собою потік часток, називаних квантами чи фотонами. Енергія кожного кванта визначається довжиною хвилі випромінювання. У результаті поглинання випромінювання молекула поглинаючого речовини переходить з основного стану з мінімальною енергією E₁ у більш високий енергетичний стан Е₂ . Електронні переходи, викликані поглинанням строго визначених квантів світлової енергії, характеризуються наявністю строго визначених смуг поглинання в електронних спектрах поглинаючих молекул. Причому поглинання світла відбувається тільки в тому випадку, коли енергія кванта, що поглинається, збігається з різницею енергій ΔЕ між квантовими енергетичними рівнями в кінцевому (E₂ ) і початковому (E₁ ) станах поглинаючої молекули:

hv = ΔЕ = Е2 – E1

Тут h – постійна Планка (h = 6,625*10^–34 Дж*с); v – частота випромінювання, що поглинається, що визначається енергією поглиненого кванта і виражається відношенням швидкості поширення випромінювання з (швидкості світлової хвилі у вакуумі с = 3*10¹⁰ см/с) до довжини хвилі λ: v = с/λ. Частота випромінювання v виміряється в зворотних секундах (с^-1 ), герцах (Гц). 1 Гц = 1 с^-1 .

Довжина хвилі λ виміряється в ангстремах (1 A = 1*10^–8 см), мікрометрах чи мікронах (1 мкм = 1 мк = 1*10^–6 м), нанометрах чи мілімікронах (1 нм = 1 ммк = 10 A = 1*10^–9 м).

Енергія випромінювання характеризується електромагнітним спектром, що охоплює область від кілометрових радіохвиль до десятих часток ангстрема γ-випромінювання і космічних променів. Для характеристики ділянки спектра часто використовують також хвильове число θ, що показує, яке число довжин хвиль приходиться на 1 см шляху випромінювання у вакуумі, і визначається співвідношенням: θ = 1/λ.

Природа смуг поглинання в ультрафіолетовій (10–400 нм) і видимої (400–760 нм) областях спектра однакова і зв'язана головним чином з числом і розташуванням електронів у поглинаючих молекулах і іонах. В інфрачервоній області (0,8–1000 мкм) вона в більшому ступені зв'язана з коливаннями атомів у молекулах поглинаючої речовини.

У залежності від використовуваної апаратури у фотометричному аналізі розрізняють спектрофотометричний метод – аналіз по поглинанню монохроматичного світла і фотоколориметричний – аналіз по поглинанню поліхроматичного (немонохроматичного) світла у видимій області спектра. Обидва методи засновані на пропорційній залежності між світлопоглинанням і концентрацією поглинаючої речовини.

4. Основні закономірності світлопоглинання

При проходженні через шар речовини (розчину) світлового потоку з інтенсивністю I₀ його інтенсивність у результаті поглинання в шарі, відображення і розсіювання зменшується до значення I. Інтенсивності падаючого світлового потоку I₀ і світлового потоку I, що пройшов через розчин, можна визначити експериментально. При відносних вимірах поглинання світла щирими розчинами утратами випромінювання унаслідок відображення і розсіювання звичайно зневажають.

Зв'язок між інтенсивностями світлових потоків I₀ і I установлюється законом Бугера-Ламберта, відповідно до якого однорідні шари тієї самої речовини однакової товщини поглинають ту саму частку падаючої на них світлової енергії (при постійній концентрації розчиненої речовини).

Математично цей закон виражається рівнянням експонентної залежності:

I = I₀ e^al (1),

де е – основа натуральних логарифмів; а – коефіцієнт поглинання; l – товщина поглинаючого шару.

Відношення:

T = I/I₀

називають пропусканням; його значення можуть змінюватися від 0 до 1. Часто цю величину виражають у відсотках. Якщо величина Т віднесена до товщини шару в 1 см, то її називають коефіцієнтом пропускання. Поглинання випромінювання характеризують оптичною щільністю:

A = lg(I₀ /I) = –lgT

Зв'язок між концентрацією поглинаючого розчину і його оптичною щільністю lg(I₀ /I) виражається законом Бера, відповідно до якого оптична щільність розчину прямо пропорційна концентрації розчиненої речовини при постійній товщині шару:

lg(I₀ /I) = k*1*C (2)

де k*1 – коефіцієнт пропорційності; С – концентрація розчиненої речовини. Залежність інтенсивності монохроматичного світлового потоку, що пройшов через шар забарвленого розчину, від інтенсивності падаючого потоку світла, концентрації забарвленої речовини і товщини шару розчину визначається об'єднаним законом Бугера-Ламберта-Бера, що є основним законом світлопоглинання і лежить в основі більшості фотометричних методів аналізу:

I = I₀ *10^–kCl (3)

де k – коефіцієнт светопоглощения, що залежить від природи розчиненої речовини, температури, розчинника і довжини хвилі світла.

При дотриманні основного закону светопоглощения оптична щільність розчину прямо пропорційна молярному коефіцієнту светопоглощения, концентрації поглинаючого речовини і товщині шаруючи розчину:

А = kCl (5)

При графічному зображенні залежності оптичної щільності від концентрації (при постійному значенні l) виходить пряма лінія. Ця пряма проходить через початок координат при відсутності поглинання світла розчинником і систематичними погрішностями.

Рівняння 4 і 5 виведені для монохроматичного світла, тобто світла визначеної довжини хвилі, що може бути виділений за допомогою спеціального оптичного пристрою – монохроматора. У фотоколориметрі вимір інтенсивності світлових потоків роблять не в монохроматичному, а в поліхроматичному світлі, тобто на досить широкій ділянці спектра – в інтервалі довжин хвиль 20–100 нм.

5. Спектри поглинання

Спектр поглинання, чи, більш коректно, абсолютний спектр поглинання речовини являє собою залежність кількості поглиненого світла від довжини хвилі.

Такі спектри для барвників у видимій області (400–700 нм) мають іноді кілька максимумів. Спектри поглинання в ультрафіолетовій (200–400 нм) і видимих областях відбивають переходи зв'язаних і незв'язаних електронів у молекулі.

Це звичайно делокализованные π-електрони подвійних С=С зв'язків і неподілені пари азоту і кисню. Оскільки, як правило, всі електрони в молекулі при кімнатній температурі знаходяться на нижньому енергетичному рівні, спектри в цій області подають інформацію про основному і першому збудженому електронні стани молекули.