Група в молекулі, що дає внесок у спектр її поглинання, називається хромофором. Такою групою є, наприклад, карбонільна група >С=О, що існує у всіх амінокислот. Іншим хромофором є пептидная група поліпептидних ланцюгів. До основних хромофорів білка відносяться залишки ароматичних кислот: триптофан і в меншому ступені тирозин і фенілаланін.

Спектр поглинання триптофану, обумовлений його індольним кільцем із системою сполучених зв'язків, володіє двома смугами поглинання з максимумами при 220 і 280 нм. У нуклеїнових кислотах основними хромофорами є пуринові і пиримідинові азотисті основи нуклеотидів. При утворенні сполучених зв'язків у молекулі енергія збудженого стану електронів зменшується, і, отже, хромофор починає поглинати світло більшої довжини хвилі.

Таке зрушення в спектрах поглинання називається батохромним. Навпаки, зрушення спектра в короткохвильову область іменується гіпсохромним. Гіперхромний і гіпохромний ефекти – це відповідно збільшення і зменшення екстинкції.

Знайти дуже близько розташовані лінії коливальних і обертальних переходів на спектрах молекул удається лише при високій роздільній здатності (роздільною здатність називається здатність приладу розрізняти дві близько розташовані лінії).

6. Методика визначення концентрації речовини в розчині

Фотометричні методи визначення концентрації розчинів засновані на порівнянні поглинання при пропущенні світла стандартними і досліджуваними розчинами. Ступінь поглинання світла фотометруємим розчином вимірюють за допомогою фотоколориметрів і спектрофотометрів. Вимір оптичної щільності стандартного і досліджуваного забарвлених розчинів завжди роблять стосовно розчину порівняння (нульового (контрольного) розчину). Як розчин порівняння можна використовувати аліквотну частину досліджуваного розчину, що містить усі додані компоненти, крім реагенту, що утворить з обумовленою речовиною забарвлену сполуку. Якщо реагент, що додається, і всі інші компоненти розчину порівняння безбарвні і, отже, не поглинають променів у видимій області спектра, то як розчин порівняння можна використовувати дистильовану воду.

Для визначення змісту речовини методом градуировочного (каліброваного) графіка готують серію з 5–8 стандартних розчинів різних концентрацій.

При виборі інтервалу концентрацій стандартних розчинів керуються наступними положеннями:

а) він повинний охоплювати область можливих змін концентрації досліджуваного розчину; бажано, щоб оптична щільність досліджуваного розчину відповідала приблизно середині градуювочної кривої;

б) бажано, щоб у цьому інтервалі концентрацій при обраних товщині кювети l і аналітичній довжині хвилі λ, (у більшості випадків λ = λ_макс світлопоглинаючої сполуки) дотримувався основний закон світлопоглинання, тобто графік А = f(C) був лінійним;

в) інтервал робочих значень λ, що відповідає інтервалу стандартних розчинів, повинний забезпечувати максимальну відтворюваність результатів вимірів.

При сукупності перерахованих умов вимірюють оптичні щільності стандартних розчинів щодо розчинника і будують графік залежності А = f(C). Отримана крива називається градуювочною чи каліброваною і має вид прямої що виходить з початку координат. Екстраполювати калібровану пряму до значень оптичних густин, що лежать вище останньої експериментально отриманої крапки, не рекомендується. Періодично (раз у тиждень чи рідше) калібровану криву перевіряють по 2–3 свіжовиготовленим стандартним розчинам. Калібровані графіки, побудовані з реактивами різних партій, як правило, не збігаються. Тому при зміні реактивів графік необхідно побудувати заново. Графік, побудований при роботі на одному приладі, не можна використовувати для розрахунків результатів, отриманих на іншому.

Визначивши оптичну щільність досвідченого розчину А_х , знаходять її значення на осі ординат, а потім на осі абсцис – відповідне їй значення концентрації С_х .

Цей метод застосовують при виконанні серійних фотометричних аналізів. Він дає гарні результати при дотриманні основного закону світлопоглинання.

На відміну від інших фотометричних методів, метод градуювочного графіка дозволяє визначити концентрацію пофарбованих розчинів навіть у тих випадках, коли основний закон світлопоглинання не дотримується. Для побудови градуювочної кривої в цих випадках наготовлюють значно більше число стандартних розчинів, що відрізняються друг від друга по концентрації не більше ніж на 10%. Такий градуировочный графік, що має на положистій ділянці кут нахилу не менш 15°, усе-таки дозволяє проводити фотометричні виміри, незважаючи на те, що між концентрацією розчину і його оптичною щільністю немає лінійної залежності. Відтворюваність визначень у цьому випадку нижче, ніж у випадку лінійної залежності А = f(C).

Для визначення концентрації речовини методом порівняння оптичних густин стандартного і досліджуваного розчинів беруть аликвотну частину досліджуваного розчину, наготовлюють з неї забарвлений розчин для фотометрування і вимірюють його оптичну щільність. Потім аналогічно наготовлюють 2–3 стандартних пофарбованих розчини обумовленої речовини відомої концентрації і вимірюють їхній оптичні щільності при тій же товщині шаруючи (у тих же кюветах).

Значення оптичної щільності досліджуваного розчину дорівнює:

А_х = ε_λ C_x l_x

Значення оптичної щільності стандартного розчину дорівнює:

А_ст = ε_λ С_ст l_ст

Розділивши одне вираження на інше одержимо:

А_х /А_ст = ε_λ C_x l_x /(ε_λ С_ст l_ст )

Тому що l_х = l_ст , ε_λ = const, то

С_х = С_ст А_х /А_ст

Метод порівняння застосовують при однократних визначеннях; він вимагає обов'язкового дотримання основного закону світлопоглинання.

Існує й інший більш точний спосіб визначення невідомої концентрації С_х , називаний методом обмежуючих розчинів. Наготовлюють два стандартних розчини з концентраціями C₁ і С₂ так, щоб оптична щільність першого з них A₁ була б менше оптичної щільності Ах досліджуваного розчину, а оптична щільність А₂ другого стандартного розчину була б, навпаки, більше, ніж А_х .

Невідому концентрацію досліджуваної речовини розраховують по формулі:

C_x = C₁ + (C₂ – C₁ )(A_x – A₁ )/(A₂ – A₁ )

7. Устаткування для фотометричних вимірів

Для фотометричних вимірів використовують дві великі групи приладів: фотоколориметри і спектрофотометри.

У колориметрах потрібні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, що обмежують ділянки спектра, у яких можуть проводиться виміри. У спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм чи дифракційних ґрат, що дозволяє встановлювати будь-як довжину хвилі в заданому діапазоні.