Реферат: Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
7. Вирусную суспензию наслаивают на 30 мл 5–45%-ного градиента сахарозы в указанном выше буфере и центрифугируют 1 ч при 12500 об/мин. После центрифугирования в центре градиента четко видна рыхлая белая полоса очищенного вируса. Эта видимая невооруженным глазом полоса и есть единственная в градиенте фракция инфекционного вируса.
Полученный вирус уже достаточно очищен, и его можно использовать в различных целях, в частности для выделения вирусной ДНК. Из фракции вирус легко осадить обычным центрифугированием. Для получения вирусных препаратов высокой степени чистоты может быть использован ряд других методов, включая повторное центрифугирование в градиенте сахарозы или CsCl. Эти методы позволяют получать препараты вируса, в которых отношение белка к числу частиц составляет менее чем 20 мкг на 1010 частиц.
1.5.2 Метод 2
Данный метод был разработан Спир и Ройзманом и Хейном и др.
1. Заражение клеток проводят по методу 1.
2. Клетки инкубируют 18–24 ч при 37°С, затем их снимают с подложки и центрифугируют при малой скорости.
3. Полученный таким образом клеточный осадок ресуспен-дируют в стандартном буфере для ретикулоцитов и в течение 10 мин дают клеткам набухнуть. Цитоплазматическую фракцию клеток получают в гомогенизаторе Даунса.
4. Клеточный гомогенат центрифугируют при малой скорости для удаления ядер и клеточного дебриса.
5. Супернатант, содержащий большую часть инфекционного вируса, наслаивают на 5–40%-ный градиент декстрана, приготовленный на трис-буфере, и центрифугируют 1 ч при 12500 об/мин. Фракция вируса видна невооруженным глазом в центре градиента.
6. Вирус из фракции осаждают центрифугированием в течение 1 ч при 20000 об/мин.
Полученный вирус уже достаточно очищен и может быть использован в различных целях. Кроме того, степень чистоты вируса можно повысить, как описано выше. Очищенный вирус, полученный любым методом, ресуспендируют в дистиллированной воде или в соответствующем буфере. Аликвоты суспензии можно использовать для заражения клеток, подсчета общего числа частиц и определения концентрации белка. Вирус хранят при –70°С, однако следует учитывать, что оттаивание ведет к частичному разрушению вирусной оболочки. На рис. 5 показаны различные вирусные частицы, обнаруженные в препаратах очищенного вируса.
1.5.3 Анализ структурных вирусных полипептидов
В большинстве случаев проводится электрофорез в пластинах полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Na, как было описано впервые Даймэком и Ватсоном. Модификация данного метода изложена в работе. Гели окрашивают кумасси бриллиантовым синим, а для авторадиографического анализа экспонируют с рентгеновской пленкой. На рис. 6 представлены спектры структурных полипептидов ВПГ-1 и ВПГ-2, полученные гель-электрофорезом. Другие характеристики этих полипептидов приведены в табл. 1.
Таблица 1. Свойства и номенклатура некоторых белков ВПГ-1 и ВПГ-2
| ВПГ-2 | Свойства | ВПГ-1 | ||||
| номер белка | структурный вирусный белок | молекулярная масса | молекулярная масса | структурный вирусный белок | номер белка | |
|
ICSP 5–8 ICSP 9 ICSP 10 ICSP 11 ICSP 12 ICSP 13–15 ICSP 22 NN ISP 34–35 NN NN ICSP 46–47 |
NS VP5 NS NS VP7–8,5 NS К-во Просмотров: 254
Бесплатно скачать Реферат: Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
| |||||