Реферат: Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
2. По окончании адсорбции культуральную среду заменяют свежей, содержащей 2% ЭТС. Инфицированные клетки культивируют при 37°С.
3. При необходимости через 48 ч после заражения культуральную среду заменяют средой, содержащей радиоактивную метку. Например, средой с 2% ЭТС и 1 мкКи/мл – метионина или же средой с 2% ЭТС и 2 мкКи/мл – аминокислот.
4. Первые признаки ЦПД проявляются через 3 дня после инфекции. Затем ЦПД становится более явным, и на 7–10 день после инфекции клетки открепляются от субстрата. Вирус следует собирать именно на этой стадии. Для получения нуклеокапсидов клетки собирают несколько раньше.
Обычно для иммунологических исследований или иммунизации животных мы выделяем CMV из культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для анализа спектров вирусных белков и т.д. специалисты рекомендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который приводится ниже. Исходным материалом для получения вирусных препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чистоты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой инфекционности препарата и целостности вирусных частиц следует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиенте плотности, предложенное Барзилаи и др. для выделения CMV, было применено Тэлботом и Алмейдиа. Метод надежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют следующим образом:
1. Клетки собирают в культуральную среду, центрифугируют 10 мин при 1500 g и 4°С, затем наслаивают 3 мл супернатанта на 9 мл градиента 30% глицерина – 35% тартрата. Градиенты готовят согласно.
2. Градиент центрифугируют 20 мин при 40000 об/мин и 4°С в роторе SW41. После центрифугирования по светорассеянию, как правило, обнаруживают три фракции: неинфекционные оболочечные частицы, вирионы и плотные частицы. Вирусные частицы каждой фракции могут быть суспендированы в буфере и при необходимости повторно очищены в таком же градиенте.
Гибсон предлагает ряд модификаций этого метода, которые успешно применяются в его лаборатории.
1. Градиенты общим объемом 18 мл готовят в 38-мл пробирках для ротора SW27. На градиент наслаивают 20 мл осветленной культуральной среды и центрифугируют 40 мин при 25000 об/мин и 4°С в роторе SW27.
2. При необходимости обычно используемый буфер трис-НС1 заменяют на 0,04 М фосфатный буфер, рН 7,4.
3. Заменяют тартрат калия на тартрат натрия, если соль калия мешает последующему анализу. Натриевая соль менее растворима при 4°С, чем калиевая.
4. При необходимости вместо тартрата можно использовать градиенты сахарозы. Условия центрифугирования те же.
2.6 Типы частиц CMV
На рис. 10 представлены электронные микрофотографии частиц CMV различной морфологии, полученные методом негативного контрастирования. Спектры структурных полипептидов этих частиц, полученные электрофорезом в полиакриламидном геле, показаны на рис. 11.
2.6.1 Неинфекционные оболочечные частицы
Аймайер и Гибсон провели детальный анализ характерных признаков данных частиц. Несмотря на их сходство по внешнему виду и белковому составу со стандартными вирионами, они не содержат ДНК и, следовательно, неинфекционны.
2.6.2 Частицы высокой плотности
Структура и состав подобных частиц проще, чем неинфекционных оболочечных и стандартных вирионов. Эти частицы представляют собой большие плотные сферы, заполненные гомогенным материалом и окруженные внешней мембраной. Они не содержат ДНК., и 90% всего их белка приходится на матриксный белок, имеющий мол. массу 69 кД.
2.6.3 Вирионы
Гибсон опубликовал подробные спектры структурных белков многих штаммов CMV человека и сравнил их с CMV обезьян. Эти данные представлены на рис. 12 и в табл. 3.
3. Герпесвирус саймири
Герпесвирус саймири можно выделить из крови и культуры клеток большинства здоровых обезьян саймири. Для своих природных хозяев этот вирус не патогенен. Однако он стал предметом пристального внимания ученых после того, как была продемонстрирована его высокая онкогенность для тканей других приматов, в особенности мармозеток из рода Saguinus. У последних в течение 2 мес после заражения развиваются злокачественные опухоли лимфатической системы. Показано, что герпесвирус саймири относится к f-субгруппе герпесвирусов.
3.1 Получение заготовок вируса
Из большого количества проанализированных клеточных культур для литической инфекции и роста различных штаммов HVS наиболее пригодной оказалась линия клеток почки обезьян дурукули. Кроме того, за небольшим исключением, для получения заготовок HVS можно использовать и клетки линии Vero. Клетки ОМК можно выращивать на большинстве культуральных сред с добавлением ТС.
Для получения заготовок вируса клетки ОМК, растущие в роллерных флаконах, заражают вирусом и культивируют 4–5 дней при 37°С. Оптимальная температура культивирования – 34°С. Однако культивирование при этой температуре может привести к возникновению температурно-чувствительных мутантов. ЦПД проявляется в образова?