Реферат: Вплив граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і стійкість мембран еритроцитів до гемолізу
1. Дослідити концентраційну залежність впливу граміцидину S на зміни форми тромбоцитів.
2. Вивчити концентраційну залежність впливу граміцидину S на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів за умов дії різної концентрації Са2+ і Mg2+ та оцінити енергію активації цього процесу.
3. Дослідити вплив різних фізико-хімічних чинників (температура, іонізуюче опромінення, перекисне окислення ліпідів мембран) на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів.
4. Вивчити концентраційну залежність гемолізу еритроцитів під дією граміцидину S та оцінити енергію активації цього процесу.
5. Дослідити вплив ліпідного складу та перекисного окислення ліпідів мембран еритроцитів на їх гемоліз за дією граміцидину S.
Об'єкти дослідження - комплекси граміцидину S з мембранами тромбоцитів і еритроцитів.
Предмет дослідження – агрегація тромбоцитів та гемоліз еритроцитів під впливом граміцидину S.
Методи дослідження – оптичний метод реєстрацій агрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів, спектрофотометрія, полум'яна фотометрія, полярізаційно-флуоресцентна мікроскопія, тонкошарова хроматографія, визначення продуктів ПОЛ, методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі було вивчено вплив граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів в умовах модифікації плазматичних мембран г-опроміненням та біологічно активними сполуками. Вперше встановлено, що взаємодія граміцидину S з інтактними тромбоцитами призводить до їх набрякання і зміни форми, подібної до такої, що відбувається під впливом відомих індукторів агрегації. Цей процес є Са2+ , Mg2+ - залежним.
Вперше продемонстровано, що граміцидин S руйнує агрегати тромбоцитів, що утворюються під впливом індукторів агрегації, не руйнуючи при цьому плазматичну мембрану клітин.
Встановлено, що зменшення впорядкованості ліпідів у плазматичній мембрані тромбоцитів та еритроцитів при їх г-опроміненні чи перекісному окисленні ліпідів веде до полегшення вбудовування граміцидину S до мембрани, але, водночас, призводить й до зменшення міцності зв'язування антибіотика до неї.
Показано, що ступінь і швидкість дезагрегації тромбоцитів граміцидином S найбільші в області структурних фазових переходів ліпідів мембран (180 С – 330 С). При вищих температурах ці параметри дезагрегації знижуються, що свідчить про більшу стійкість агрегатів при температурі тіла.
На еритроцитах здорових донорів і людей з серцево-судинними захворюваннями вперше доведено, що біологічна активність граміцидину S залежить від вмісту холестерину та відношення холестерин/фосфоліпіди в мембранах. Його збільшення знижує гемолітичну дію антибіотика по відношенню до цих клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані експериментальні результати виявили характер взаємодії граміцидину S з інтактними тромбоцитами і еритроцитами - набрякання, зміна форми і руйнування агрегатів перших і гемоліз других, а також особливості цих процесів в залежності від структурного стану клітинних мембран – рівня їх розпорядкованості під дією іонізуючого опромінення, перекисного окислення ліпідів і відношення холестерин/фосфоліпіди. Отримані дані розширюють уявлення про механізми взаємодії пептидних антибіотиків з клітинними мембранами і можуть бути використані при розробці штучних антибіотиків, не руйнуючих тваринні клітини. Їх можна також залучати при читанні загальних і спеціальних курсів лекцій «Біоорганічна хімія», «Біохімія», «Клітинна фізіологія» тощо у вищих навчальних закладах.
Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і задач, вибір об'єктів та методів досліджень, обговорення та інтерпретація одержаних експериментальних результатів і формулювання висновків було здійснено разом з науковим керівником.
Автор особисто опрацював фахову літературу за темою дисертації, виконав експериментальні дослідження і провів статистичний аналіз одержаних результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені і обговорені на: конференції молодих вчених біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Карабіна (2005), І Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2005), засіданні Харківського біохімічного товариства (2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових журналах та 3 в матеріалах і тезах конгресів, з'їздів, конференцій, які повністю відбивають основний зміст дисертації.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 148 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків. Список використаних літературних джерел містить 218 найменувань. Робота ілюстрована 21 рисунком і 14 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури представлені дані про структуру, властивості і біологічну дію граміцидину S на бактеріальні і тваринні клітини. Розглянуті сучасні уявлення про основи його біологічної активності, а також не з’ясовані ще молекулярні механізми взаємодії антибіотика з нативними мембранами.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження проведені на тромбоцитах і еритроцитах здорових донорів і людей з серцево-судинними захворюваннями (атеросклероз і післятромбофлебічний синдром) обох статей віком 41 – 60 років.
Збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) та еритроцитарну масу одержували з крові методами [MacCenzieR.D., 1974] та [GrossmanS.J. andJollowD.J.,1992] відповідно. В усіх експериментах кількість клітин в ЗТП становила, в середньому, ~ 2,5 Ч 108 / мл, а в суспензії еритроцитів ~ 106 / мл. Кількість клітин у зразках підраховували в камері Горяєва. Тромбоцити фарбували метиленовим синім.
Отримані зразки зберігали у скляному силикованому посуді і всі вимірювання проводили на протязі 3 – 5 годин після приготування і не пізніше 24 годин після отримання крові.
Агрегацію тромбоцитів викликали додаванням до 0,9 мл ЗТП 0,1 мл розчину АДФ (Reanal, Угорщина) в концентрації 2 Ч 10 -5 М.
Для дослідження впливу граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів 2-% розчин антибіотика в етанолі (фармацевтичний препарат, Фармахим, РФ), розводили розчином 0,15 М NaCl, рН 7,4 в 30 – 50 разів до концентрації, в якій він додавався до ЗТП та суспензії еритроцитів. Попередні контрольні досліди показали, що етанол в концентрації до 1% не впливає на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів.
Процеси агрегації тромбоцитів і гемолізу еритроцитів в різних експериментах вивчали за змінами світлопропускання (Т), або оптичної густини (D) [Лопатин В.Н.,Седько Ф.Я.,1988]. Вимірювання проводили на фотоелектроколориметрі ФЕК-М з максимумами світло пропускання 540 нм для ЗТП і 670 нм для еритроцитарної суспензії. Запис кінетики досліджуваних процесів проводили автоматично на самописці ЕПП-09М.
За одержаними кінетичними кривими визначали ступінь і швидкість цих процесів. Ступінь агрегації і дезагрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів розраховували, як різницю між початковими і поточними значеннями світлопропускання (∆Т), або оптичної густини (∆D) і виражали в абсолютних величинах. Для обох типів клітин швидкість досліджуваних процесів визначали за тангенсом кута нахилу дотичної до відповідної ділянки кінетичної кривої на її піввисоті. Для еритроцитів виміряли також час їх повного гемолізу.
По кривим швидкості гемолізу еритроцитів і дезагрегації тромбоцитів в діапазоні температур 40 С- 440 С за рівнянням Ареніуса розраховували енергії активації цих процесів.
Структурні властивості мембран тромбоцитів і еритроцитів змінювали шляхом індукції перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Для цього ЗТП і суспензію еритроцитів інкубували протягом 15 хв з 0.5 М аскорбінової кислоти і 12 мкМ солі Мору. Інгібування ПОЛ здійснювали розчином (50 мкг/мл) б - токоферолу в гексані (Sigma, США). Інтенсивність ПОЛ тромбоцитарних і еритроцитарних мембран оцінювали за накопиченням в зразках сполук малонового діальдегіду (МДА) по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. Концентрацію МДА розраховували на основі коефіцієнту його молярної екстинкції (е = 1,53 Ч 105 М-1 см-1 Ч л) за інтенсивністю поглинання при л = 532 нм [EsterbauerH., CheesemanK.H., 1990].