Учебное пособие: Практикум по энзимологии
Печатается по решению редакционно-издательского совета Пензенского государственного педагогического университета им. В. Г. Белинского
УДК 577.1
Соловьев В. Б. Практикум по энзимологии: учебно-методическое пособие / В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин. – Пенза, 2007. – 52 с.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия».
© Соловьев В. Б., 2007
© Генгин М. Т., 2007
© ПГПУ им. В. Г. Белинского, 2007
Введение
Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:
1. Методы определения активности ферментов.
2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.
3. Методы выделения и очистки ферментов.
4. Изучение субклеточной локализации ферментов.
5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.
Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.
Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.
Все замечания и пожелания будут приняты авторами с благодарностью.
Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы
Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).
2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):
| опыт | контроль |
| 20 мл вытяжки фермента | 20 мл вытяжки фермента |
| – | Нагревание 10 мин на кипящей водяной бане |
| 25 мл 0,1 н перекиси водорода | 25 мл 0,1 н перекиси водорода |
| Инкубация 30 минут при комнатной температуре | |
| 5 мл 10 % H2 SO4 | 5 мл 10 % H2 SO4 |
Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.
Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:
5H2 O2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K2 SO4 + 5O2 + 8H2 O,
согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.
Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 – 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7∙1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить 
= 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин – (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.
Содержание отчета
1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.
2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.
Работа 2. Фотометрическое определение активности трипсина
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, паранитроанилин, 100 мкМ раствор бензоил-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА) в фосфатном буфере *, раствор трипсина (10 мкг/мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl, ацетон.
* Приготовление раствора БАПНА. 43,5 мг препарата суспендируют в 1 мл ацетона, после этого прибавляют примерно 80 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6). Смесь нагревают в водяной бане при температуре 75-80°С до полного растворения препарата, затем доводят объем до 100 мл. Раствор можно хранить в течение месяца в темном месте.
** Приготовление раствора трипсина. 3 мг фермента растворяют в 3 мл 0,0025 н HCl, получается маточный раствор. Рабочий раствор готовят путем стократного разведения маточного раствора дистиллированной водой (500 мкл маточного раствора трипсина помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят дистиллированной водой до метки).
--> ЧИТАТЬ ПОЛНОСТЬЮ <--