Учебное пособие: Практикум по энзимологии
В пробах определяют величину оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-3 (или КФК-2) при 364 нм и строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации п-НА.
2. Для определения активности препарата трипсина берут 6 пробирок – 3 опытных и 3 контрольных. Активность фермента определяют по следующей схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37°С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37°С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Реакционную смесь переливают в кюветы и измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п‑НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой.
Содержание отчета
1. Калибровочный график по пара-нитроанилину:
|
Конц. п-НА |
|
Опт. плотность |
2. Рассчитайте активность фермента.
3. Напишите рекомендуемое систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.
Работа 3. Флюориметрическое определение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ*, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR)**, 1 н HCl, хлороформ, печень животного, реактив Фолина, реактивы А и В для метода Лоури.
* Приготовление раствора ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ растворяют в 5 мл дважды перегнанного этилового спирта.
** Приготовление раствора DNS-FLR: К 1 мг DNS-FLRдозатором прибавляют 50 мкл метанола, а затем – 7,5 мл натрий-ацетатного буфера рН=5,6.
200 мг печени гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат хранят на льду. Пробирки каждой параллели (3 опытных и 3 контрольных) помещают, предварительно подписав, в один штатив. Раскапывают реактивы по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37 °С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37 °С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течении 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури (см. примечание 1) Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а = 
Содержание отчета
1. Рассчитайте активность фермента в исследуемом материале.
2. Опишите фермент и его предполагаемую биологическую роль. Напишите предполагаемый систематический код фермента.
Работа 4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза трипсином бензоил-аргинин-пара-нитроанилида методами Лайнуйвера-Бэрка и Эйзенталя-Корниш-Боудена. Определение типа ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, растворы БАПНА следующих концентраций: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, раствор трипсина (10 мкг/мл), раствор ингибитора трипсина* (10 мкг/мл), 1 н HCl.
* Приготовление раствора ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Рабочий раствор готовят непосредственно перед опытом путем стократного разведения исходного раствора дистиллированной водой.
Для определения Vmax и Км данной реакции, а также типа ингибирования трипсина строят график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора (в системах координат Лайнуйвера-Берка и Эйзенталя-Корниш-Боудена). Для каждой концентрации субстрата выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Активность фермента в присутствии ингибитора определяют по схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| 100 мкл раствора ингибитора трипсина (10 мкг/мл) | 100 мкл буфера |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37°С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37°С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости строят на миллиметровой бумаге.
Содержание отчета
1. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Лайнуйвера-Бэрка.
2. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Эйзенталя и Корниш-Боудена.
Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.